玉米褪綠斑駁病毒研究進展及防治策略

李敬娜 王乃順 宋偉 趙久然 邢錦豐

（北京市農林科學院玉米研究中心 玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室，北京 100097）

玉米褪綠斑駁病毒（Maize chlorotic mottle virus，Mcmv）是我國重要的對外檢疫性病毒［1］，隸屬番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）玉米褪綠斑駁病毒屬（Machlomovirus），是該科屬的唯一成員［2］。Mcmv于1974年首次在秘魯被報道［3］，目前在阿根廷、巴西、墨西哥、美國等美洲國家，泰國、中國等亞洲國家以及肯尼亞、剛果等非洲國家均有分布，對玉米產業構成嚴重威脅［4-6］。Mcmv單獨侵染會導致玉米產量降低10%-15%［7］。當它與玉米矮花葉病毒（Maize dwarf mosaic virus，Mdmv）、甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，Scmv）或小麥線條花葉病毒（Wheat streak mosaic virus，Wsmv）等馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）病毒復合侵染時發生協生作用，引起嚴重的玉米病毒病害——玉米致死性壞死病（Maize lethal necrosis disease，Mlnd），致使玉米產量損失高達90%［8-9］。本文綜述了Mcmv的生物學特性、分布與危害、鑒定與檢測、基因組結構與功能等方面的研究進展，并對其防治策略進行探討，以期為Mcmv的深入研究和綜合防治提供理論指導。

1 Mcmv的生物學特性

1.1 形態特征

Mcmv病毒粒子由外殼蛋白（Capsid protein，CP）及其包裹的單鏈正義RNA（Single-stranded positive-sense RNA，ssRNA） 構 成［10］。 病 毒 粒子呈二十面體結構，其外殼由180個蛋白結構亞基組成［11-12］。病毒粒子直徑約30 nm，相對分子質量 6.1×106，其中核酸占 18%［11-12］。標準沉降系數S20W=109 S，在氯化銫溶液中的浮力密度為1.365 kg/L，在從感病玉米分離的汁液中鈍化溫度為85-90℃［12］。

1.2 寄主及致病癥狀

玉米［13］、甘蔗（Saccharum officinarum）［14］和石茅（Sorghum halepense）［13］等是 Mcmv的自然寄主。Mcmv不能侵染雙子葉植物，但能侵染多種單子葉（僅限于禾本科）植物［4］。Bockelman等［15］對44種禾本科植物的測試結果顯示，大麥（Hordeum vulgare）、小 麥（Triticum aestivum）、 粟（Setaria italica（L.）Beauvois）、黍（Panicum miliaceum）、高粱（Sorghum bicolor）等19種植物可被Mcmv侵染，是Mcmv的實驗寄主。

Mcmv單獨侵染玉米主要導致葉片褪綠斑駁和植株生長略微緩慢等輕微癥狀［16］。當它與Mdmv、Scmv或Wsmv等馬鈴薯Y病毒科病毒復合侵染時可導致嚴重的玉米病害Mlnd［8-9］。Mlnd在玉米的不同生長時期發生，表現癥狀也不一樣。當Mlnd在玉米幼苗期發生時，會引起葉片褪綠斑駁，植株矮化，葉片從邊緣向內逐漸壞死，最終導致整株植物死亡；當Mlnd在玉米莖稈伸長期發生時，會導致葉片褪綠斑駁并從邊緣開始壞死，植株不能抽穗，玉米棒畸形或不結籽粒；當Mlnd在玉米生長后期發生時，會導致葉片邊緣部分壞死，包葉較早干枯，玉米籽粒不飽滿［8，17］。可見，Mcmv與馬鈴薯Y病毒科病毒復合侵染比Mcmv單獨侵染所引起的癥狀要嚴重很多。這是因為Mcmv與馬鈴薯Y病毒科病毒發生協生作用，而協生作用的主要特點就是加重病害，導致病毒含量發生改變［18］。據報道，Mcmv和Wsmv復合侵染時，兩者的病毒積累量較單獨侵染時均增加［19］。Mcmv和Scmv復合侵染時，Mcmv的病毒積累量比單獨侵染時提高1.7-5.4倍，而Scmv的病毒積累量沒有顯著變化［20］。對Mcmv致病機理初步研究表明，Mcmv單獨侵染及其與Scmv復合侵染都能引起宿主轉錄組水平和細胞學水平的變化，且復合侵染所引起的變化更為顯著。在轉錄組水平，復合侵染比單獨侵染造成更多的基因差異表達，在這些差異表達的基因中，參與生長素合成、水楊酸合成、羥脂合成等與植物防御反應相關的基因都出現了較為顯著的變化。在細胞學水平，復合侵染造成的破壞比單獨侵染更為嚴重，其中以葉綠體和線粒體最為明顯。單獨侵染植株維管束鞘細胞葉綠體中的淀粉粒與健康植株中的無顯著差別，而復合侵染植株中的這類淀粉粒明顯變小，暗示其光合作用受到影響。單獨侵染和復合侵染植株的線粒體中均出現絲狀結晶樣物質，線粒體結構均被破壞，且復合侵染植株的線粒體被破壞的更早更嚴重，推測可能是病毒引起的結晶類物質破壞了線粒體的完整結構。線粒體是植物進行呼吸作用的主要場所，其結構被破壞導致呼吸作用受阻。光合作用和呼吸作用同時受阻對植物來說可能是致命的，這可能是復合侵染導致植株系統性壞死的直接原因［8］。

1.3 傳播途徑

Mcmv可通過機械、種子和昆蟲介體傳播。它易通過根或葉機械接種傳播［12］。玉米種子可傳播Mcmv，盡管其傳播效率僅為0.04%，但種子傳播是Mcmv遠距離傳播的主要方式［21］。MCMV的昆蟲介體包括葉甲和薊馬，目前已報道的能夠傳播Mcmv的葉甲包括跳甲（Systena frontalis）、玉米跳甲（Chaetocnema pulicaria）、黑角負泥蟲（Oulema melanopa）、南方玉米根蟲（Diabrotica undecimpunc-tata）、北方玉米根蟲（D. longicornis）和西方玉米根蟲（D. virgifera）等 6種［22］，能夠傳播 Mcmv的薊馬包括威廉期花薊馬（Frankliniella williamsi）［4］和西花薊馬（Frankliniella occidentalis）［11］2種。6種葉甲和威廉期花薊馬的幼蟲和成蟲均能傳播Mcmv，傳播方式為半持久型，無潛伏期［8］。西花薊馬的傳毒特性目前尚未清楚。

1.4 Mcmv的分布與危害

Mcmv于1974年首次在秘魯被報道［3］，之后在阿根廷、巴西、墨西哥、美國等美洲國家迅速傳播［4］。在較長的一段時間里Mcmv僅分布在美洲，直到2005年才在泰國發現該病毒［8］。近年Mcmv在非洲流行爆發，最先于2011年在肯尼亞被發現［5］。在肯尼亞Mcmv常與馬鈴薯Y病毒科病毒復合侵染引起Mlnd，2012年肯尼亞Mlnd發生率為22.1%，造成玉米減產12.6萬t，產量損失高達90%，折合經濟損失 5 200萬美元［9，16］。隨后，Mcmv迅速傳播到盧旺達［23］、剛果［6］、埃塞俄比亞［24］等非洲國家，給當地玉米產業造成嚴重打擊。2016年報道在西班牙的玉米樣品上檢測到Mcmv，說明Mcmv已擴散到歐洲。我國于2009年首次在進境玉米種子中檢測到Mcmv［7］，同年在云南省元謀縣的玉米田間發現該病毒［25］，隨后發現四川玉米樣品也感染 Mcmv［8］。我國是僅次于美國的世界第二大玉米種植國，播種面積為3 066-3 333萬hm2，Mcmv一旦爆發將會對我國造成巨大經濟損失，據估算，Mcmv爆發將造成我國直接經濟損失高達140.95億人民幣［12，26］。

2 Mcmv的鑒定與檢測

目前用于鑒定和檢測Mcmv的方法主要包括血清學方法和分子生物學技術。酶聯免疫吸附反應法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作為最常用的血清學方法被廣泛用于Mcmv的檢測。Stenger等［27］利用商業化雙抗體夾心ELISA（Double antibody sandwich- ELISA，DAS-ELISA）試劑盒檢測玉米葉片樣品中Mcmv的相對滴度。Wu等［28］利用純化的Mcmv病毒粒子作為抗原制備了抵抗Mcmv的單克隆抗體和多克隆抗體，再利用這些抗體建立了三抗體夾心ELISA（Triple antibody sandwich-ELISA，TAS-ELISA），該方法可靈敏、特異、快速地檢測Mcmv，對純化Mcmv的最低檢出濃度為25 pg/mL。

聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）、環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和下代測序（Next generation sequencing，NGS）等分子生物學方法被用于檢測Mcmv。張露茜等［29］建立并比較了Mcmv的普通反轉錄PCR（Reverse transcription PCR，RTPCR）、SYBR Green I real-time RT-PCR 及 TaqMan realtime RT-PCR 3種檢測方法發現，TaqMan real-time RT-PCR靈敏度最高，SYBR Green I real-time RTPCR次之，普通RT-PCR最差，其RNA最低檢出量依次為 1.61、7.86和 161.40 fg。Chen等［30］建立了檢測Mcmv的RT-LAMP方法，該方法僅需恒溫孵育60 min即可完成反應，特異性強，靈敏度比普通RT-PCR高10倍，且結果可視化，是檢測Mcmv簡易、快速、有效、靈敏的手段，可用于Mcmv的日常檢測。NGS技術克服ELISA和PCR只能針對一些特定病毒或一種病毒的某些株系的缺陷，是病毒檢測的強大工具。Adams等［31］利用NGS技術鑒定并表征了導致肯尼亞Mlnd發生的兩種病毒——Mcmv和Scmv。

此外，還有一些檢測Mcmv的新方法。Wang等［32］利用未修飾的金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）作為比色探針，結合不對稱PCR方法檢測Mcmv，該方法物種專一性高，操作簡單，且結果可視化，無需任何昂貴的儀器設備和生化試劑，是Mcmv中小規模檢測的潛在有用工具。曾倡［33］利用表面等離子共振生物傳感器技術對Mcmv進行檢測，發現該方法特異性好、靈敏度高、耗時短，最低檢測限為1 ng/mL，檢測時間僅需15 min。Huang等［34］利用石英晶體微天平生物傳感器技術同樣可以快速檢測Mcmv，但該方法靈敏度低于表面等離子共振生物傳感器技術，最低檢測限為250 ng/mL。

3 Mcmv的基因組結構與功能

Mcmv含有一條長4.4 kb的基因組RNA（genomic RNA，gRNA），此外還能在寄主細胞中合成兩條亞基因組RNA（subgenomic RNA，sgRNA），分別是1.47 kb的sgRNA1和0.34 kb的sgRNA2。基因組5'端含有帽子結構，3'端無poly（A）尾巴，共具7個開放讀框（Open read frame，ORF），分別編碼大小為32、50、111、7、31、7和25 kD的蛋白，將這些蛋白依次命名為p32、p50、p111、p7a、p31、p7b和p25，其中，p32、p50和p111直接由gRNA翻譯得到，而 p7a、p31、p7b和p25的合成則 依 賴于sgRNA1（圖 1）［8，17］。

圖1 MCMV基因組結構示意圖［17］

P32由Mcmv gRNA 5'端的第一個ORF編碼， 為 Mcmv特 有， 在 NCBI（National Center for Biotechnology Information）中找不到與其序列相似的同源蛋白［35］。在病毒復制和移動過程中P32不是必須的，但其缺失會導致病毒積累量顯著下降，病毒擴散速度明顯變慢，宿主癥狀明顯減輕，推測它可能具有輔助病毒復制、加強病毒移動及干擾植物防御的作用［36］。p50位于p32下游19 nt的位置，由ORF2編碼，當其終止密碼子被通讀時翻譯得到蛋白 p111［37］。p50和 p111與 Mcmv同科代表種番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）的對應蛋白p33和p92具有較高相似性，猜測它們與p33、p92功能相似，亦是分別作為病毒的復制輔助蛋白和RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）［8］。與預測相符，在缺失突變體中的研究結果表明p50和p111是Mcmv復制過程中唯一必需的兩種蛋白［36］，生物信息學分析顯示p111含有在RNA病毒RdRP中高度保守的“GDD”模體［37］。sgRNA1編碼的4個蛋白均與病毒的胞間移動或長距離運輸相關。p7a的C端與tombusvirid病毒編碼的運動蛋白1（Movement protein1，MP1）在序列上具有很高相似性，p7b與panicoviruses編碼的MP2相似性高，MP1和MP2是很多病毒胞間移動所必需的［36，38-39］，在缺失突變體中的研究結果表明p7a和p7b亦是Mcmv胞間移動所必需的兩個運動蛋白［36］。p31是p7a終止密碼子被通讀后的產物，在NCBI中找不到其同源蛋白，為Mcmv所特有。在病毒胞間移動過程中p31不是必需的。p31參與病毒的長距離運輸，它直接或間接加強病毒的系統移動，是病毒實現有效系統侵染所必需的［36］。Mcmv基因組體外翻譯得到的蛋白中只有大小在25 kD的蛋白能被病毒粒子CP的抗血清檢測到，表明p25為Mcmv的CP［10］。作為唯一的結構蛋白，CP具有包裹并保護病毒基因組的作用。此外，與天竺葵線型病毒（Pelargonium line pattern virus，PLPV）一樣，Mcmv的CP也是病毒胞間移動所必需的［36］。目前尚未發現sgRNA2編碼的蛋白，sgRNA2是否是真的sgRNA，其有何功能仍有待進一步研究。

4 Mcmv的防治策略

4.1 加強檢驗檢疫

Mcmv主要通過帶毒種子進行遠距離傳播，因此勢必要加強對玉米種子的檢驗檢疫工作，以防止Mcmv的遠距離擴散。作為全球主要玉米消費大國，我國每年需從國外進口大量玉米，加強對玉米種子的檢驗檢疫可在很大程度上防止Mcmv的入侵［40］。目前，Mcmv僅在我國云南、四川和臺灣發生，尚未蔓延到全國，因此必須要加強產區間玉米種子調運的管理并嚴格執行檢疫措施，以防止該病毒在全國范圍內擴散［40-41］。

4.2 培育及選用抗病品種

培育及選用抗病品種是最經濟、有效、環保的Mcmv防治措施。培育抗病品種的主要手段包括常規雜交育種和轉基因分子育種，而對現有種質資源進行抗性分析是常規雜交育種工作的基礎。在夏威夷的抗性實驗結果顯示，幾乎所有的溫帶自交系和雜交系對Mcmv都高度易感，很多熱帶自交系和品種對Mcmv表現高抗，但沒有觀察到完全免疫的株系或品種，甜玉米對Mcmv高度易感［42］。Mahuku等［9］在美國俄亥俄州對63個玉米自交系進行了抗性評價，其中50個株系在初次篩選階段因與易感對照（自交系Oh28）表現相似而被淘汰，剩余13個株系經歷了3輪實驗評價，結果顯示所有株系在接種4周后均出現癥狀，但N211和KS23-6僅在后期出現輕微癥狀，Oh1VI自交系和6個Oh1VI ⅹ Oh28重組自交系癥狀發生明顯推遲。這些在俄亥俄州表現抗性的株系在肯尼亞田間接種實驗中也表現出Mcmv抗性，表明它們是Mcmv抗性育種的潛在種質資源［9］。初步遺傳性狀研究表明玉米抗Mcmv性狀是由多基因控制的，抗性為部分顯性，因此在抗Mcmv雜交育種時選擇的親本都應該具有抗性［42］。轉基因分子育種亦是植物抗病育種的常用手段，但目前未見抗Mcmv轉基因的報道。

4.3 化學防治

Mcmv本身不能通過化學藥劑控制，但可利用化學藥劑殺死其介體昆蟲來達到防治Mcmv的目的［43］。利用靶向葉甲和薊馬的化學藥劑對玉米種子進行包衣處理，可以有效防治苗期葉甲和薊馬，減輕Mcmv的發生與危害［44］。在植株發病初期或介體昆蟲開始遷往田間時，噴施適當殺蟲劑消滅葉甲和薊馬或使其蟲口密度降低，能有效控制Mcmv的傳播和擴散［44］。為了達到良好的殺蟲效果，殺蟲劑應每1-2周噴施1次，且每月輪換使用不同類型殺蟲劑，以免產生耐藥性［43］。

4.4 栽培管理

加強栽培管理主要是通過減少病源傳播及增強植株抗病能力兩個方面防治Mcmv。具體措施包括：（1）建立無病留種田，使用無毒或脫毒種子，降低種子傳播的危險；（2）及時發現并拔除染病植株，對染病植株集中深埋或燒毀，減少侵染源；（3）及時清除田間地頭雜草，防止Mcmv通過一些禾本科雜草作為中間寄主傳播，同時可減少介體昆蟲數量并防止介體昆蟲在雜草上越冬；（4）調整播期，避免介體昆蟲發生高峰期與玉米感病敏感期重合；（5）與非禾本科作物輪作，并嚴格控制輪休期；（6）合理布局，避免品種單一化；（7）農耕器具消毒，防止Mcmv通過摩擦接種傳播；（8）合理施肥和灌溉，增強植株抗病能力；（9）做好介體昆蟲流行的預報和防治，減少蟲源和毒源［18，44-45］。

5 結語

Mcmv是影響玉米產量的重要病原之一，在世界范圍廣泛分布。它單獨侵染玉米僅能引起輕微癥狀，造成玉米產量小幅下降；而當它與Mdmv、Scmv和Wsmv等馬鈴薯Y病毒科病毒復合侵染時會引起嚴重的玉米病害Mlnd，造成玉米產量大幅下降，對玉米產業構成嚴重威脅。目前對Mcmv的研究已經取得了初步成果，但仍存在一些問題尚未得到解決。例如，Mcmv除了通過機械、種子和昆蟲介體傳播是否還存在其它傳播途徑，除了目前已知的6種葉甲和兩種薊馬，是否存在其它昆蟲介體，在這些昆蟲介體中，哪種是當地主要的傳毒介體，如何真正有效地控制這些介體。西花薊馬在我國適生范圍廣泛，且其寄主多，繁殖能力強，可能會導致Mcmv的大范圍擴散［12］，但其傳毒特性如何，氣候等環境因素對Mcmv的發生危害有何影響，尚未發現Mcmv sgRNA2編碼的蛋白，sgRNA2是否是真的sgRNA，其有何功能，這些問題有待進一步研究。

我國是玉米種植大國，且Mdmv、Scmv和Wsmv在我國分布較為廣泛［18］，Mcmv已在我國云南、四川和臺灣發生，若其大規模爆發，很可能會和Mdmv、Scmv或Wsmv復合侵染導致Mlnd，造成巨大經濟損失，因此勢必要加強Mcmv的防治工作，嚴防其進一步擴散。這就要求我國有關部門盡快建立Mcmv快速、簡便和準確的檢測方法，以保障我國農業生產安全。轉基因分子育種是植物抗病育種的常用手段，目前未見抗Mcmv轉基因的報道，培育抗Mcmv轉基因植株亦是今后研究的主要任務。

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