樟樹NBS-LRR類抗病基因家族分析與CcRNL基因克隆

鄭永杰 伍艷芳 李江 章挺 汪信東

（江西省林業科學院 國家林業局樟樹工程技術研究中心，南昌 330032）

抗病基因（R基因）在植物抵御病原菌的入侵過程中起著關鍵的作用。在植物與病原菌的相互作用中，植物會分泌由R基因編碼的R蛋白，直接或間接識別病原菌分泌的效應因子（Avr），激活信號傳導并引發一系列防御反應，從而抑制病原菌對植物的侵染過程。NBS-LRR類基因是目前植物中成員數量最多的一類R基因家族，NBS-LRR類基因主要由核苷酸結合位點（Nucleotide-binding site，NBS）和富亮氨酸重復結構（Leucine-rich repeat，LRR）編碼組成。NBS結構域主要負責ATP和GTP的水解及信號的傳導［1］，而LRR結構域則負責病原菌蛋白的識別和相互作用［2］。根據N末端序列特征，NBS類抗病基因主要分為TNL（TIR-NBS-LRR）抗病基因和CNL（CC-NBS-LRR）抗病基因。有研究發現部分CNL類抗病基因在CC結構域內存在編碼RPW8基因的區域，命名為RNL類抗病基因。擬南芥RPW8類基因對白粉病具有廣譜抗性［3］，異源表達能夠增強煙草對白粉病菌［4］和水稻對稻瘟病菌的抗性。病原微生物侵染植物時，RPW8類基因通過激活水楊酸（Salicylic acid，SA）信號通路，誘發抗病反應［5-6］。

目前，不同植物中克隆超過140個抗病基因，其中80%屬于NBS-LRR類基因。NBS-LRR抗病基因家族已成為植物抗病研究的熱點，已在擬南芥［7］、水稻［8］、楊樹［9］、葡萄［10］和木薯［11］等植物中展開。樟樹（Cinnamomum camphoraL. Presl.）是自然界中較少受病原體侵害的優良抗性種質資源，但在生長過程中亦受部分病菌侵襲、尤其對苗期生長威脅較大。文獻報道，由殼梭孢菌（Fusicoccumsp.）引起的殼梭孢潰瘍病、擬莖點霉菌（Phomopsissp.）引起的擬莖點潰瘍病和球二孢（Lasiodiplodiasp.）引起的球二孢潰瘍病，嚴重時樟樹發病率和死亡率將分別高達90%和80%以上［12-16］；子囊菌亞門茶藨子葡萄座腔菌（Botryosphaeria ribis）與半知菌亞門桑莖點菌（Phoma moricola）引起的爛皮病和由膠孢炭疽病（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）引起的炭疽病嚴重時也可致樟樹整株死亡［17-18］；變色擬盤多毛孢（Pestalotiopsis versicolor（Speg.）Stey.）引起的擬盤多毛孢枝枯病及根腐病對樟樹生長危害也較大［16］。樟樹白粉病主要發生在苗期，在不通風的苗圃中可致大面積爆發，引起幼株死亡，成年樟樹對白粉病具有較好的抗性。目前樟樹白粉病菌還未分離鑒定。研究樟樹抗病基因家族不但有助于自身病害防治而且可為其它易受病害侵襲的植物提供優良抗源。在前期研究工作中，江香梅等［19］利用Illumina測序技術完成了樟樹5個化學類型的葉組織轉錄組測序。本研究在此基礎上對樟樹葉組織轉錄組數據中NBS-LRR家族基因進行了鑒定和生物信息學分析，并對當中2個RNL類基因進行了全長克隆和表達分析，以便進一步開展樟樹中NBS-LRR基因的功能研究。

1 材料與方法

1.1 材料

樟樹幼苗感白粉病葉片和正常葉片均于2016年5月取自江西省林業科學院苗圃中，取樣材料經液氮中迅速冷凍，-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 基因序列鑒定 基于前期研究獲取的樟樹葉轉錄組注釋數據，篩選出注釋結果為NBS-LRR的Contig序 列， 利 用GENSCAN（http://genes.mit.edu/GENSCAN.html）預測基因，并且翻譯為蛋白序列；進一步將得到的蛋白序列分別通過Pfam（http://pf am.xfam.org/）和 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）驗證；去除非全長序列，得到候選的具有全長ORF的NBS-LRR序列。

1.2.2 基因序列的生物信息學分析 利用Muscle軟件對樟樹NNS-LRR序列進行多重比對分析；利用MEGA7.0.14軟件輸出系統發育樹構建結果；利用在線分析工具ProParam（http://web.expasy.org/protparam/）對樟樹NBS-LRR的基本理化性質進行分析；利用MEME尋找樟樹NBS-LRR蛋白序列結構域的潛在保守元件。

1.2.3 樟樹CcRNL1和CcRNL2基因序列擴增 樟樹總RNA的提取使用RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue（TaKaRa公司）試劑盒，具體步驟參考說明書，然后用DNase I消化去除基因組DNA。取RNA 樣品 2 μg，以 Oligo（dT）Primer為引物進行反轉錄合成cDNA（PrimeScriptTMII 1stStrand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa）。利用 Primer 6.0 對目的基因序列進行引物設計（表1），采用LA Taq保真酶PCR擴增目的基因。PCR反應體系為：cDNA 50 ng，10×LA PCR Buffer II（Mg2+free）5 μL，MgCl2（25 mol/L）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mol/L）8 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，加超純水至終體積50 μL。PCR 擴增程序：94℃ 預變性 3 min；94℃ 變性45 s，56℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 2.5 min，35 個循環；72℃ 延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，回收目標大小擴增條帶（天根DNA回收試劑盒），回收產物鏈接到pMD18-T 載體上（TaKaRa），轉化到大腸桿菌TOP10中，菌液PCR鑒定陽性克隆，委托上海生工進行目標基因測序。

1.2.4 樟樹CcRNL1和CcRNL2基因的表達模式分析 以樟樹正常葉和感白粉病葉組織的cDNA為模板，通過實時定量（qRT-PCR）和半定量RT-PCR（SqRT-PCR）檢測CcRNL1和CcRNL2基因相對表達量。用Oligo6軟件進行RT-PCR引物設計，樟樹Actin基因為內參基因（表1）。qRT-PCR 反應體系 ：2×SYBR premix Ex TaqTM 12.5 μL，50×ROX Reference DYE 0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 25 ng，加超純水至終體積 25 μL。擴增程序 ：95℃ 2 min ；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40 個循環；添加溶解曲線。在實時熒光定量PCR儀（Bio-RAD，CF×96TMReal-Time System）上進行操作，每個樣品重復3次。實驗數據統計參照2-△△CT計算相對表達量［20］。SqRT-PCR反應體系為：cDNA 20 ng，10×PCR Buffer II（Mg2+free）2 μL，MgCl2（25 mol/L）1.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mol/L）1.3 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，加超純水至終體積 20 μL。擴增程序 ：94℃ 預變性 3 min ；94℃ 變性45 s，56℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，30 個循環。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

表1 引物序列信息

2 結果

2.1 樟樹NBS-LRR基因的鑒定

基于樟樹葉組織轉錄組序列的注釋結果，篩選注釋為NBS-LRR的序列，利用Pfam和SMART在線網站驗證后獲得具有NBS保守結構域的NBS-LRR蛋白序列。進一步去除非全長的NBS-LRR序列之后，在樟樹轉錄組數據中共篩選到28個具有全長序列的NBS-LRR基因（表2）。樟樹NBS-LRR家族成員的ORF長度為2 118-3 378，編碼氨基酸個數為705-1 125，分子量在80.85-128.10 kD，理論等電點為5.35-9.03，不穩定系數為44.05-55.84、為不穩定蛋白；平均疏水性為負值，為親水性蛋白。樟樹NBSLRR蛋白不存在信號肽序列，為非分泌蛋白。蛋白質結構域預測結果顯示，樟樹NBS-LRR蛋白都具有特征結構域NBS結構域，C末端都具有LRR結構域，其中26條序列N末端存在螺旋卷曲（Coiled-coiled，CC）結構，屬于CNL類基因；2條序列N末端存在RPW8結構域，屬于RNL類基因；未發現TNL類基因。

2.2 樟樹NBS-LRR基因系統進化樹及保守結構域分析

進一步對樟樹NBS-LRR基因進行聚類分析，利用Mega 7.0.14軟件以鄰接法構建了樟樹NBS-LRR蛋白序列的系統進化樹，并且利用在線分析工具MEME鑒定樟樹NBS結構域的Motif特征。進化樹結果（圖1）顯示，28個NBS-LRR蛋白被分為5個亞組。樟樹的NBS保守結構域包含8個Motif（表3），其中6個Motif為已知元件，分別為P-loop、GLPL、RNBS-A、RNBS-B、RNBS-C和Kinase-2元件，2個為未知元件。

2.3 樟樹CcRNL基因的克隆與序列分析

基于對樟樹NBS類抗病基因家族的生物信息學分析，本研究挑取N末端存在RPW8結構域的RNL類基因（CL4083.Contig1_All 和 CL4083.Contig2_All）進行克隆。PCR擴增如圖2顯示，擴增的目的基因ORF條帶大小約2 400 bp，分別將其命名為CcRNL1和CcRNL2。經過測序，CcRNL1序列長度為2 460 bp，CcRNL2序列長度為2 466 bp。序列比對結果顯示，CcRNL1和CcRNL2序列在氨基酸水平上相似性為71%，除含有NBS基因家族保守結構域中的P-loop，Kinase-2，GLPL motif和C末端的LRR motif外，在N末端具有RPW8 motif，均屬于NBS基因家族的RNL類基因（圖3）。

表2 樟樹NBS-LRR基因家族生物信息學分析

2.4 樟樹CcRNL蛋白的系統進化分析

為研究樟樹CcRNL蛋白的系統進化關系，從NCBI數據庫下載典型的植物RNL蛋白及近源蛋白氨基酸序列，與本研究獲得的CcRNL基因的氨基酸序列進行多重比對，并采用鄰接法（NJ）構建系統發育樹。結果（圖4）顯示，RNL蛋白主要分為ADR1亞家族和NRG1亞家族兩類，其中樟樹CcRNL蛋白與擬南芥ADR1蛋白聚為一類，屬于ADR1類亞家族，且與油棕（Elaeis guineensis）的親緣關系最近。

2.5 CcRNL基因的表達模式分析

為進一步探究CcRNL1和CcRNL2的功能，利用實時定量PCR和半定量PCR對兩者在樟樹感白粉病葉片和正常葉片中的表達模式進行分析。結果（圖5）顯示：2個基因在樟樹正常葉和感白粉病葉中均有表達，但相對表達水平有所差異，其中CcRNL1在樟樹感白粉病葉中的表達明顯高于正常葉，而CcRNL2在感白粉病和正常葉中的表達沒有明顯差異。由此可見CcRNL1可被樟樹白粉病菌誘導表達，推測其可能與響應樟樹白粉病脅迫反應有關，但還有待于進一步實驗驗證。

圖1 樟樹NBS-LRR抗病基因系統發育關系分析

表3 樟樹NBS結構域保守元件分析

3 討論

圖2 樟樹CcRNL1和CcRNL2基因的擴增圖

NBS-LRR基因家族是植物中發現的成員最多的抗病基因家族，也是目前植物抗病性研究的重點和熱點。樟樹是自然界中較少受病原體侵害的優良抗性種質資源，挖掘樟樹R基因尤其具有廣譜抗性的R基因對其它易感病植物新抗性種質創制具有重要意義。但目前樟樹基因組沒有公布，給樟樹優良抗性基因的挖掘和功能研究帶來了困難。本實驗室通過對樟樹5種化學類型的葉轉錄組深度測序，構建了含55 955條樟樹unigene序列的數據庫。基于此數據庫，借助生物信息學的手段對樟樹NBS-LRR抗病基因進行了研究。利用葉組織轉錄組數據一共獲得了28個具有完整ORF的NBS-LRR序列，根據氨基酸保守結構域的不同劃分為2類，包括26條CNL基因和2條RNL基因，基因數量偏少，可能與組織差異表達有關。另外，葉轉錄組中未發現TNL類抗病基因，這和水稻［8］、高粱［25］的情況類似，體現了樟樹作為基底被子植物系統發育特征，即進化地位介乎于單子葉植物和真核雙子葉植物之間。

圖3 CcRNL1和CcRNL2蛋白序列比對

目前，已從不同植物中克隆得到NBS-LRR類基因。例如，馮艷芳等［26］克隆了花生AhDNrp基因，該基因屬于CNL類抗病基因，在花生根部特異表達，且參與花生黃曲霉抗病反應過程。Peart等［27］克隆了NRG1基因，并且利用病毒誘導沉默技術（VIGS）驗證了NRG1基因對煙草花葉病毒（TMV）表現出抗性。本研究克隆了兩個樟樹RNL類的基因，分別命名為CcRNL1和CcRNL2，序列長度為2 460 bp和2 466 bp，兩者在氨基酸水平上相似性71%。結構域分析發現，該類基因除含有典型的NBS結構域和LRR結構域之外，在N端還存在RPW8結構域。RNL類基因劃分為ADR1類亞家族和NRG1類亞家族兩類，聚類分析結果顯示CcRNL屬于ADR1類亞家族。研究表明，擬南芥ADR1通過激活SA信號通路，參與白粉病和霜霉病的宿主防御反應［28］。在本研究中，樟樹幼苗受白粉病菌侵襲后，CcRNL1基因的表達量相比正常生長個體顯著上升，說明該基因可能參與了響應白粉病菌脅迫反應過程，是否通過SA信號通路有待進一步研究。

圖4 NBS-LRR抗病基因系統發育關系分析

4 結論

圖5 實時定量和半定量檢測CcRNL1和CcRNL2白粉病誘導表達

本研究以樟樹葉組織轉錄組數據為基礎，利用生物信息學方法在轉錄組水平上對NBS-LRR基因家族進行了鑒定和分析。在樟樹葉組織轉錄組中鑒定獲得了28個NBS-LRR基因，包括26個CNL類基因和2個RNL類基因。在樟樹葉組織中克隆了2個RNL類R基因，分別命名為CcRNL1和CcRNL2，聚類分析結果顯示二者都屬于ADR1類亞家族成員。半定量分析顯示CcRNL1受樟樹白粉病菌誘導表達，推測其可能參與了響應白粉病菌脅迫反應過程。

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