小分子BH3模擬物S1的抗腫瘤分子藥理機制研究

彭云滔 于蘭 王俊鋒 張幸

（廣西桂林醫(yī)學人體解剖學教研室 廣西 桂林 541004）

腫瘤是一種十分常見的疾病類型，很多惡性腫瘤對患者身體健康影響較大，同時有較高的幾率造成患者死亡。在Bcl-2家族蛋白中，Bcl-2-like蛋白具有抗凋亡作用，對于惡性腫瘤的存活發(fā)揮作用。在Bcl-2家族蛋白間的相互作用界面，BH3溝槽，使小分子抗癌藥物最為關鍵的靶點[1]。相關研究表明，在Mcl-1、Bcl-2等蛋白BH3溝槽中，占據(jù)的小分子對于Bcl-2-like蛋白抗凋亡作用可進行拮抗，進而達到高特異性、廣譜、高效的抗腫瘤作用。將此類分子，成為小分子BH3模擬物。

1.非DNA靶向小分子Mcl-1/Bcl-2雙抑制劑S1

在對苊并雜環(huán)類DNA靶向分子的研究當中，存在特殊小分子S1，其無法使DNA雙螺旋分子空間構象改變，也不能將超螺旋質粒DNA切斷，但其細胞毒性則由于其它DNA靶向分子。如圖1所示，在相關試驗中，部分化合物損傷Ⅰ型超螺旋形式質粒DNA，電泳結果則顯示缺刻型Ⅱ型DNA。在DNA、化合物S1共同作用下，也未出現(xiàn)Ⅱ型質粒DNA條帶，因此說明其無法將超螺旋DNA切斷。雖然小分子無法將DNA超螺旋切斷，但可利用靜電吸引、溝結合、嵌入等方式，和DNA之間產生相互作用，從而使DNA雙螺旋空間構象發(fā)生變化。苊并雜環(huán)類小分子S1，經(jīng)研究證明無法促使DNA構象的變化，也無法將DNA切斷，因而屬于非DNA靶向小分子。采取相關試驗研究，比較DNA靶向分子和S1，殺傷培養(yǎng)腫瘤細胞的效果[2]。利用MTT法，檢測化合物抑制人乳腺癌細胞、人宮頸癌細胞的效果。結果表明，小分子Ⅱ-1具有切刻超螺旋DNA的作用，對于兩種癌細胞半致死濃度分別為8.4uM和7.2uM。小分子Ⅰ-3嵌入式靶向DNA小分子，對于兩種癌細胞的半致死濃度分別使13.6uM和10.2uM。不過，非DNA靶向小分子S1，對于兩種癌細胞可產生最強的抑制作用，因此，研究S1抗腫瘤分子藥理機制，具有重要的意義。通過分別檢測細胞凋亡的內源性途徑、外援性途徑，明確S1誘導凋亡的作用機制。對兩種途徑調往信號的區(qū)分，主要依據(jù)使caspase級聯(lián)反應，研究結果表明，具有不同激活標志的內源途徑（caspase9）和外援途徑（caspase8），最終均通過相同作用機制（caspase3），誘導凋亡。對三種物質的活性進行檢測，結果表明，采用濃度梯度的方式，將S1作用于人結腸癌細胞，可檢測到caspase9激活，而caspase8、caspase3并未激活。作用時間不斷延長，超過24h后，caspase9活性繼續(xù)增加，caspase3的活性也明顯提高。由此能夠表明，S1屬于調往誘導劑。

圖1 質粒切斷試驗

2.基于S1的Mcl-1蛋白BH3溝槽結構特征

經(jīng)細胞學研究能夠得出，S1可對Mcl-1蛋白發(fā)揮功能拮抗作用，經(jīng)NMR研究，可以從結構方面表明，S1能夠對Mcl-1的BH3溝槽進行占據(jù)，進而起到功能抑制的效果。基于S1對Mcl-1的BH3溝槽結構特征進行研究，先拆分S1分子，對利于小分子結合的熱點結合單元進行研究。運用結構單元、分子片段的結合效率指標，可以對結構單元對小分子結合的貢獻準確的體現(xiàn)。拆分S1，如圖2所示，分別得到不同的片段，包括1-二氰基亞甲基-2-氧-苊（片段6）、苊醌（片段5）、氰基乙酰胺（片段4）、硫代嗎呤（片段3）、8-氧-8H-苊并（1，2-b）吡咯-9-腈等（片段2）。利用這些片段分子，通過ELISA法對其Mcl-1蛋白親和力進行檢查。通過NMR研究證實，S1可通過片段中的羰基，結合精氨酸R263，形成氫鍵。羰基可能對完整分子S1和R263氫鍵作用模式加以保存，從而得到的關鍵作用力具有更高的配體效率[3]。對R263結構單元外亞口袋結構特征進行進一步的研究，使用片段6為hit進行分子生長，在R263A突變蛋白ITC實驗中，片段6的親和力和R263相當。不過無法和hot spot發(fā)生作用，因而片段6的配體效率要低于片段4。經(jīng)ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，在取代基分子增加的同時，小分子對于Mcl-1將會產生更高的親和力。所以，盡管片段6無法對R263進行占據(jù)，但可以對其亞口袋進行占據(jù)，從而提升親和力。對片段7系列分子自由能對重原子數(shù)研究，結果表明二者之間具有線性的關系，且現(xiàn)行相關系數(shù)為0.98。另外，片段6系列分子，具有平行于片段4系列分子的優(yōu)化路徑，二者具有相同的斜率。對不同分子結構、不同分子大小的Mcl-1抑制劑進行相同的研究，選擇棉子酚衍生物7系列、8系列，研究表明，其斜率比較接近于4系列和6系列，因而說明Mcl-1抑制劑和蛋白的結果，都會遵循特定斜率，并具有線性關系，同時不會受到分子結構、或R263結合位點的影響。這主要是由于Mcl-1蛋白亞口袋具有獨特的性質。

圖2 S1拆分過程

3.高特異性BH3模擬物S1分子藥理學機制

Mcl-1、Bcl-2但那白，能夠利用BH3結合域分別和BH3-only蛋白、Bak、Bax的BH3肽段蛋白等產生分子識別，形成異源二聚體，對其促凋亡功能產生拮抗。對S1分別從定性、定量、體內、細胞內、體外等不同角度、不同方面進行研究，明確其與Bcl-2-like蛋白競爭結合的親和力強度，對異源二聚體進行解離，使促調往蛋白得到激活與釋放，進而發(fā)揮出抗腫瘤的效果。在Bcl-2家族蛋白中，Bak、Bax是發(fā)揮調往作用通路終點分子，在凋亡過程中，作為最終的執(zhí)行者。很多研究對Bcl-2家族促凋亡、抗凋亡成員相互作用進行研究，其中Bcl-2蛋白、Bax蛋白具有相互影響和相互牽制的作用，對促凋亡、抗凋亡功能進行平衡[4]。S1在細胞內，可以作為雙靶向BH3模擬物，對促調往蛋白、抗凋亡蛋白形成的二聚體進行解離，同時促進Bak、Bax的釋放。采用細胞內熒光共振能量轉移實驗，通過不同時間、濃度條件，對S1干擾凋亡Bcl-2/Bax進行平行檢測，從而證實S1通過對Bcl-2家族PPI干擾，對細胞凋亡進行誘導。Bak、Bax蛋白，在細胞中具有不同分布，其中Bak蛋白位置在線粒體，釋放后能夠和Bax、同源二聚體等形成異源二聚體，促進細胞色素c的釋放，進而發(fā)揮誘導凋亡的效果。Bax蛋白在整個細胞中均有分布，部分在線粒體、部分在胞漿。細胞在凋亡壓力下，胞漿Bax經(jīng)構象改變，向線粒體外膜轉移，從而促進細胞色素c的釋放。Bcl-2家族蛋白之間，具有十分復雜的PPI，最終將Bak、Bax作為最終執(zhí)行者，對細胞是否凋亡進行決定。研究結果表明，Bak/Bax完全依賴的細胞凋亡，就是S1誘導，因而S1在BH3模擬物中，具有較高的特異性。在人體中，小分子藥物需經(jīng)過血液循環(huán)，到達腫瘤組織。而藥物進入腫瘤細胞后，其藥物濃度是否能夠保證對Mcl-2/Bcl-2靶蛋白形成足夠的抑制作用，通過BH3功能的作用機制模擬，來誘導凋亡，對于小分子在人體中效果的發(fā)揮，低毒抗癌作用等都有著決定性的作用。

4.基于S1的Bcl-2家族藥物靶點網(wǎng)絡

在Bcl-2家族當中，抗凋亡Bcl-2-like蛋白是小分子發(fā)揮靶向、低毒、特異性抗腫瘤的一個良好的靶點。不過，很多研究發(fā)現(xiàn)，如果BH3只具有單一靶點，例如ABT-737等Bcl-2蛋白抑制劑，難以對腫瘤細胞Bcl-2家族網(wǎng)絡進行有效控制。分別選擇具有Mcl-1過表達的人白血病細胞系、人肝癌細胞系、人結腸癌細胞系，以及具有Bcl-2過表達的人小細胞肺癌細胞系進行研究。S1處理細胞當中，和體外檢測S1拮抗Mcl-2、Bcl-2蛋白相同，處理24h之后，細胞都出現(xiàn)了濃度依賴細胞凋亡，同時具有較為接近的凋亡比例。因而能夠看出，S1通過濃度依賴的方法，對Mcl-1高表達腫瘤細胞凋亡進行誘導，具有良好的作用效果。另外對S1誘導凋亡動力學過程，以及細胞Mcl-1蛋白表達量關系進行研究，結果表明，盡管S1可對高表達Mcl-1蛋白腫瘤細胞凋亡產生誘導，不過相比于Mcl-1地表達的細胞，凋亡作用時間顯然更長，因而可見Mcl-1的高水平表達，會對大量調往產生延遲。Mcl-1蛋白壽命較短，其蛋白水平和Caspase降解體系、蛋白酶體系有著重要的聯(lián)系[5]。采用Western印記試驗，檢測Mcl-1/Bcl-2蛋白水平變化，并采用特異識別活化caspase3抗體檢測其激活情況。結果表明，Mcl-1地表達細胞，S1作用12h，Mcl-1蛋白水平降低，并檢測到caspase3激活。隨時間增加，Mcl-1蛋白水平持續(xù)下降，caspase3激活量也持續(xù)增加。可見在S1的作用下，Mcl-1動態(tài)變化，對于凋亡能夠發(fā)揮調控的效果，細胞通過對Mcl-1蛋白的上調，抑制ABT-737誘導凋亡發(fā)生，延遲S1誘導凋亡大量發(fā)生。

圖3 S1誘導Mcl-1/Bcl-2蛋白水平變化及caspase3激活檢測

5.小結

綜上所述，小分子BH3模擬物S1，是一種十分有效的抗腫瘤化合物，能夠對腫瘤分子產生有效的抑制。本文通過對其抗腫瘤分子藥理機制的研究，為以后的臨床試驗、臨床應用、個性化治療等提供依據(jù)。

[1]項喜艷,孫連坤.BH3-only模擬物S1通過活化SIRT3分子擾亂卵巢癌細胞糖代謝的機制[J].中國病理生理雜志,2015(10):1845-1845.

[2]王曉波,石敏,慕俐君,等.急性髓系白血病原代細胞BCL-2家族蛋白表達與BH3模擬物S1關系的研究[J].中國實驗血液學雜志,2015,23(1):39-44.

[3]李景煜,劉宇博,宋婷,等.BH3模擬物S1誘導人類白血病細胞株K562凋亡的作用機制[J].白血病·淋巴瘤,2012,21(12):723-726.

[4]李亞平,鐘加滕,衣豪偉,等.小分子化合物S1誘導B16細胞凋亡及其機制的研究[J].中國實驗診斷學,2012,16(2):216-218.

[5]唐靖,羅麗娜,張海龍,等.基于procaspase-3激活的抗腫瘤活性分子SM-1吸收機制研究[J].長沙醫(yī)學院學報,2015(1):542-546.