液相色譜-四級桿串聯質譜法測定涼皮湯料中罌粟堿含量

劉新才，宗萬里，魯 剛

(威海市食品藥品檢驗檢測中心，山東 威海264209)

罌粟堿([1-(3，4-二甲氧基苯基)甲基]-6，7-二甲氧基異喹啉)是自然界中存在的一種重要的芐基異喹啉類生物堿，在阿片類植物，如罌粟的殼和籽中含量較高.罌粟殼是罌粟科植物的干燥成熟果殼，主要生物活性成分為嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可汀等，具有斂肺、澀腸和止痛等功能，被用于治療久咳、久瀉、脫肛和脘腹疼痛等疾病，但久服易成癮.由于罌粟殼的易成癮性，國內有些不法商販將其作為食品添加劑加入到食品中，例如火鍋底料、方便面調料、涼皮湯料等，以吸引顧客.因此國家有必要通過檢測罌粟殼中含有的罌粟堿成分以實現對罌粟殼使用情況的監督.檢測食品中罌粟堿含量的方法主要有氣相色譜法[1，2]、氣質聯用法[3]、液相色譜法[4-7]、ELISA法[8，9]、液質聯用法[10].本文建立了使用液相色譜-串聯質譜法對涼皮湯料中罌粟堿含量的檢測方法，該方法測量準確，樣品前處理簡單，適用于在時限要求較高的情況下，實驗室大批量的樣品檢測.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜儀；Thermo fisher TSQ QUANTUM ULTRA三重四極桿質譜檢測器(配電噴霧離子源ESI)； HILIC液相色譜柱(2.1 mm ×150 mm，3.5 μm，XBridge)，沃特世公司；0.22 μm有機相針管濾頭，Agela 公司；漩渦振蕩器(MS3 Digital)，IKA公司；高速冷凍離心機(Neofuge 23R)，上海力申科學儀器有限公司；純水機(Milli-Q Direct8)，密理博公司；電子天平(JY10002)，上海舜宇恒平科學儀器有限公司.

乙腈：色譜純，默克公司；甲酸：≥98%，Sigma-Aldrich公司；甲酸銨:≥99%，for HPLC，Shanghai Macklin Biochemical Co.，Ltd；罌粟堿標準物質:10 μg/mL，天津阿爾塔有限公司；實驗用水為超純水.

含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨水溶液的制備方法：稱取0.63 g甲酸銨溶于1 L水中，加入1 mL甲酸，經0.22 μm水相濾膜過濾.

1.2 儀器條件

1.2.1 液相色譜條件

HILIC液相色譜柱：2.1 mm×150 mm(i，d)，3.5 μm；柱溫：35 ℃；流動相梯度洗脫條件見表1所示.

表1 流動相梯度洗脫條件

1.2.2 質譜參考條件

(1)電離方式：電噴霧電離，正離子掃描模式；

(2)噴霧電壓：3.5 kV(正模式)；

(3)蒸發器溫度：常溫；

(4)鞘氣(N2)壓力：35 arb；

(5)輔助氣(N2)流量：10 arb；

(6)碰撞室(氬氣)壓力：1.5 mTorr；

(7)離子傳輸毛細管溫度：350 ℃；

(8)掃描方式：選擇反應監測(SRM)；

(9)質譜divert valve狀態：0～3 min時處于InjectWaste狀態，3～6 min時處于LoadDetector狀態，6～15 min時處于InjectWaste狀態；

(10)碰撞能量如表2所示.

表2 罌粟堿的離子碎片及碰撞能量

1.3 標準溶液的制備

準確吸取0.5 mL罌粟堿標準溶液至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為1 μg/mL的罌粟堿標準溶液.

首先從1 μg/mL的罌粟堿標準溶液中，分別吸取20.0，40.0，80.0，100.0，200.0 μL，加入到5個含有1.0 g罌粟堿空白樣品的50 mL刻度離心管中，然后往每個刻度離心管中分別加入乙腈至10 mL，渦旋混合器提取1 min，經高速離心機以8 000 rpm/min離心5 min，得到濃度分別為2，4，8，10.0，20.0 ng/mL的含有罌粟堿的標準溶液.分別取10 μL每個質量濃度不同的標準溶液注入液相色譜-串聯質譜聯用儀進行分析，利用外標法繪制標準曲線.

1.4 樣品前處理

稱取1.00 g(精確至0.01 g)涼皮湯料樣品于50 mL刻度離心管中，加入乙腈至10 mL，渦旋混合器提取2 min，經高速離心機以8 000 rpm/min離心5 min，取清液用0.22 μm的針頭濾膜過濾后注入液相色譜-串聯質譜聯用儀進行分析.

2 結果與討論

2.1 樣品前處理

罌粟堿能夠溶解在乙腈中，乙腈對樣品中的蛋白具有一定的沉淀作用，而且油脂不溶于乙腈.使用乙腈對樣品中的罌粟堿進行提取，經過高速離心機離心后，得到澄清的上層溶液，上層溶液能夠較為容易地通過0.22 μm的有機濾膜.樣品處理液中乙腈與水的比例接近9：1，與流動相中有機相與水相的初始比例一致.

2.2 色譜及質譜條件

本文采用HILIC色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，在梯度洗脫的條件下對罌粟堿進行分離洗脫，罌粟堿在HILIC柱上有較好的保留，且保留時間在4.4 min左右.在質譜條件方面，利用質譜檢測器自身所具有的方法優化功能，首先選出罌粟堿的三個豐度最強的子離子，然后選取其中豐度最強的子離子設為定量離子，其余兩個設為定性參考離子，最后利用儀器所帶軟件優化出每個離子對的最佳碰撞能量，最佳碰撞能量如表2所示.

2.3 色譜圖

在1.2的色譜及質譜條件下，分別得到罌粟堿標準品在SRM方式下的總離子流圖、空白樣品的總離子流圖和加標空白樣品的總離子流圖，如圖1、2、3所示.加標樣品譜圖無干擾，在該色譜條件下，色譜結果良好.

圖1 標準樣品在SRM方式下的總離子流圖

圖2 未知樣品SRM方式下的TIC色譜圖

2.4 標準曲線和最低檢出限

在以上實驗條件下，以標準物峰面積y為縱坐標，質量濃度x(μg/mL)為橫坐標繪制標準曲線，得到線性方程，再以基線噪聲10倍峰面積對應的質量濃度為定量限(S/N=10)[11]，回歸方程、相關系數及檢出限如表3所示.

圖3 加標未知樣品SRM方式下的TIC色譜圖

目標物測定濃度范圍/(ng/mL)線性回歸方程相關系數定量限/(μg/kg)罌粟堿2～20y=157476x+1144040.99751.25

2.5 精密度和加標回收實驗

取不含罌粟堿的涼皮湯料空白樣品進行加標回收實驗，分別向1 g不同樣品中添加1 μg/mL罌粟堿標準溶液20，100，200 μL，即樣品中罌粟堿含量為分別為20，100，200 μg/kg.按上述1.3.2樣品處理方法進行樣品處理，每個濃度水平做6次平行處理.按1.2色譜及質譜條件進行測定，精密度、回收率計算結果如表4所示.可以看出，采用本方法所得數據能夠滿足檢測要求.

表4 樣品添加回收和精密度實驗 (n=6)

2.6 未知樣品測定

利用液相色譜-吊聯質譜檢測方法對市售的8份購自不同商販的涼皮湯料中罌粟堿含量進行檢測，均未檢出罌粟堿.

3 結論

通過實驗建立了涼皮湯料中罌粟堿含量的液相色譜-串聯質譜檢測方法.樣品經過乙腈處理，離心后取上清液注入液相色譜-串聯質譜儀進行檢測，通過樣品空白基質加標繪制標準曲線的方法對回收率以及在電噴霧離子源上可能產生的樣品基質效應進行校正，利用質譜儀自帶的divert valve分流閥分流流動相以降低對離子源以及質譜檢測器的污染.該方法精密度及加標回收率均滿足要求，前處理簡單、結果穩定，適合實驗室大批量樣品的快速檢測.

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