基于Caco-2細胞模型評價食品營養物質的研究進展

黃璐瑤，梁 鵬

1 Caco-2細胞模型概述

Caco-2細胞是由人類結腸腺癌細胞所衍生而來的，該細胞有許多性質類似于小腸的腸細胞，形態學上與小腸的腸細胞相似。體外培養的Caco-2細胞融合分化后形成一種能表達微絨毛的單層細胞與相鄰細胞間緊密結合形成連續的單層，細胞邊緣呈刷狀，是一種良好的腸道吸收模型。它們和小腸上皮細胞一樣含有各種轉運蛋白質、酶和核受體等轉運系統，如MRP2，mRNA，BCRP等蛋白質；細胞色素P450 1A（CYP1A）、亞硫酸鹽轉移酶（SULTs）、谷蛋白轉移酶（gst）、UDP-葡糖基轉移酶（UGTs）等代謝酶；肝臟受體（LRH-1）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）、糖皮質激素受體（GR） 和VD受體（VDR） 等多種受體。因此，Caco-2單層細胞模型被廣泛應用于探索藥物吸收和識別機制，或研究其他抑制劑的抑制機制，或轉運蛋白和酶的誘導物[1]。近年來Caco-2細胞模型也常用于食品營養科學領域中，主要開展并研究Caco-2細胞模型對食品營養物質的吸收作用，以及其他干擾因素對營養成分吸收的干擾機制[2]。對近年來基于Caco-2細胞模型開展的食品營養成分的研究進行綜述，以期為基于Caco-2細胞模型開展食品營養科學研究提供參考。

Caco-2細胞單層的中電鏡圖（a）和室膜上的放大圖 （b） 見圖1。

2 食品營養物質在Caco-2細胞模型中的吸收代謝

隨著Caco-2細胞模型在食品領域中的廣泛應用，有必要對近年來不同食品營養物質成分在Caco-2細胞模型中的吸收情況進行綜述，如食品多肽類、多糖類、多酚類、礦物質元素、黃酮類及其他類等。

圖1 Caco-2細胞單層的中電鏡圖（a）和室膜上的放大圖（b）

2.1 多肽類

多肽是由α-氨基酸之間縮合而成的，大多數多肽來自于自然界中，也有部分多肽屬于人工合成肽。多肽對于人體是必不可少的，其功能較多，可以作為運輸載體調節人體代謝、與不同的酶系相互作用等。例如，霍艷姣等人[3]檢測了鱈魚魚肉蛋白肽的抗氧化活性和生物利用率，發現相同質量的魚肉蛋白肽和魚肉經Caco-2細胞模擬轉運吸收后，魚肉蛋白肽比魚肉有著更高的生物利用率（9.1%）和抗氧化活性，且分子量越小的魚肉蛋白肽的生物利用率越高。

此外，劉冬等人[4]通過系列試驗發現降血壓肽Val-Leu-Pro-Val-Pro（VLPVP） 在Caco-2單層細胞中有較高的轉運穩定性，在pH值為7.4時，VLPVP的轉運量在Caco-2細胞中達到最大，且去氧膽酸鈉（旁路運輸促進劑）能顯著促進Caco-2細胞對VLPVP的轉運，說明VLPVP的轉運方式是以旁路擴散的方式為主，并且其外排作用大多是由多藥耐藥相關蛋白2（MRP2） 所產生。

Ohno Yumiko等人[5]研究了不同種類植物凝集素在Caco-2細胞中對食物因子的運輸作用，發現這些凝集素增加了異黃酮的運輸和鈣離子的轉運，但不影響糖苷配基、二肽、肌肽、鵝肌肽的運輸，說明植物凝集素以特定的糖結合方式來轉運食物因子。WGA和CGA增加了鈣離子運輸的同時TER值減少，但SBA的TER值沒有變化，表明凝集素對Caco-2細胞緊密連接的作用較弱。

另外，Shigeru Katayama等人[6]利用Caco-2單層細胞研究了雞蛋卵黃蛋白磷酸肽（PPPs） 對過氧化氫的保護作用，發現PPPs抑制了經過H2O2處理的Caco-2細胞中丙二醛的形成，并且磷含量高的PPPs的保護作用高于不含磷的PPPs，說明磷和肽結構在對抗Caco-2細胞氧化應激作用中起著關鍵作用。

王波[7]利用Caco-2細胞對酪蛋白肽的進行模擬吸收試驗，研究發現當肽分子量在500～1 600 Da時，Caco-2細胞的運輸方式主要為旁路運輸，分子量為500 Da時，細胞的主要轉運方式為PepT1載體調節通路運輸；低疏水性的肽和帶負電荷的肽組分有較高的生物利用率；而在Caco-2細胞中，有著較強疏水性的肽更易通過轉胞吞作用進行吸收轉運。

以上研究表明，利用Caco-2細胞模型可以有效分析出一些食品多肽的生物利用度及其在細胞中的轉運機制，可以通過Caco-2細胞模型研究新型多肽在人體中的吸收情況。

2.2 多糖類

多糖是一種由單糖聚合而成的一種大分子物質，廣泛分布于自然界中。已有研究表明，多糖具有多種生理功能，包括抗衰老、降血糖、抗病毒等[8]。劉德萍等人[9]發現，菊糖的抗氧化機理是通過提高細胞中的過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶和谷胱光肽過氧化物酶的活力，從而起到一定的細胞抗氧化保護作用。并且，菊糖對Caco-2細胞抗氧化保護作用有兩重性效果，即菊糖質量濃度低時，有一定的抗氧化性，但超過一定的質量濃度后將會導致Caco-2細胞死亡（0.2～0.8 mg/mL的質量濃度最為合適）。

Soler-Rivas C等人[10]從食用菌中分離出水溶性平菇多糖提取物，并研究Caco-2細胞對其的響應調控機制。研究數據表明，水溶性平菇多糖提取物在體外處理Caco-2細胞體系時可以抑制結腸癌入侵基底膜。

另外，Ranaldi G等人[11]將殼聚糖、其他聚陽離子、聚-L-賴氨酸進行比較，確定了三者對Caco-2細胞緊密連接通透性的影響。研究表明，三者都能增強細胞的緊密連接通透性，其中殼聚糖和PEI受濃度的影響（殼聚糖為0.000 2%～0.01%，PEI為0.000 2%～0.002%），而聚-L-賴氨酸的影響來源于其分子量。從試驗中可知，殼聚糖對Caco-2細胞不具有毒副作用，殼聚糖與腸細胞的相互作用會誘導細胞通透性的相對增加。每天食用該化合物作為膳食補充劑或食品添加劑，可能導致腸黏膜屏障功能的變化。

上述研究說明，食品多糖類物質在Caco-2細胞中能夠影響細胞的抵抗機制，增強其抗氧化性并且可能導致細胞黏膜發生變化，在未來可以利用多糖物質對Caco-2細胞進行一定程度的改性。

2.3 多酚類

多酚類物質廣泛存在于天然植物之中，被人們稱為是一種天然抗氧化劑，具有著抗氧化、抗衰老等功效。國內外學者研究了不同植物中提取得到的多酚，Yi W等人[12]利用Caco-2細胞單層評估了藍莓中花青素提取物的吸收情況，并研究了不同糖苷配基及化學結構對不同類型花青素生物利用度的影響。研究結果表明，藍莓中的花青素可以以完整的糖醛形式通過Caco-2細胞單層轉運，但轉運吸收效率較低，平均為3%～4%（在Dp-glc中小于1%），但低于一些苷元多酚的轉運效率，造成這種低吸收率的原因可能是由于花色苷的親脂性差；3個不同品種的藍莓花青素的轉運吸收效率沒有顯著差異。結果表明，減少游離羥基和OCH3基團可以降低花青素的生物利用度。此外，基于半乳糖的花青素的生物利用率低于基于葡萄糖的花青素。

此外，Johnston K等人[13]研究了不同種類的膳食多酚對Caco-2細胞中葡萄糖攝取的影響。在經過Na+處理的細胞中，黃酮糖苷和非糖基化多酚抑制細胞中葡萄糖的攝取，而糖苷配基和酚酸沒有影響；在沒有Na+的條件下，糖苷配基和非糖基化多酚抑制葡萄糖攝取，而糖苷和酚酸無影響。數據表明，糖苷配基抑制葡萄糖攝取，而糖苷抑制葡萄糖的活性轉運。Na+存在時，有利于細胞通過SGLT1蛋白質攝取葡萄糖；而無Na+條件有利于通過GLUT蛋白質攝取，說明多種類型的膳食多酚可以同時通過2種轉運體影響體內腸道葡萄糖轉運。

另外，Bellion P等人[14]研究了蘋果汁（AEs）、果渣（APE） 和果皮提取物（PE） 在Caco-2細胞中減少DNA氧化損傷和誘導抗氧化劑防御的潛力，富含槲皮素的PE和APE在培養24 h后（PE＞APE） 最有效地減少DNA氧化損傷和ROS水平。直接抗氧化活性排列順序為AEs＞PE＞APE。研究表明，來自蘋果的富含多酚的提取物通過降低細胞ROS水平有效減少DNA氧化損傷，但產生防御效果的原因是由細胞防御機制介導而不是由抗氧化活性（多酚的自由基清除活性）介導。

除此之外，Manna C等人[15]利用Caco-2體外細胞模型研究了3,4-二羥基苯基乙醇（DPE） 在腸道運輸的分子機制，數據表明DPE為被動擴散運輸，并且是雙向的；表觀滲透系數表明DPE在腸道水平上被定量吸收。此外，橄欖油的營養效益可能與DPE及其前體，橄欖苦苷糖苷配基的含量高低有關。

2.4 礦物質元素

近年來，利用Caco-2細胞模型所研究的礦物元素主要以鐵元素（Fe）為主，Fe是一種人體不可缺少的微量元素之一，其對人體的作用涵蓋多個方面，應該更加深入研究關于礦物元素在人體中的吸收利用情況。Glahn R P等人[16]通過Caco-2細胞模型研究對比了15種不同基因型糙米中Fe的生物利用度，研究發現Azucena基因型糙米中表現出的Fe的生物利用度最高，其植酸與Fe的比例最低，為13.8∶1。例如，將過量的抗壞血酸加入到細胞中，能夠增加Fe的生物利用度（抗壞血酸與鐵的比例為10∶1）；花色素苷、肌醇磷酸、原花青素和單寧類化合物能夠有效抑制Fe吸收，其中肌醇磷酸對Fe的抑制作用最大。

此外，Puyfoulhoux G等人[17]也利用Caco-2細胞模型測量了Fe強化螺旋藻中Fe的生物利用度，與牛肉、酵母、小麥粉、硫酸鐵的生物利用度進行比較發現，Fe螺旋藻顯示出了高鐵可用性，Fe強化螺旋藻的Fe生物利用率在Caco-2細胞中與牛肉中的無顯著差異，但高于酵母、小麥粉等。研究表明，Fe強化螺旋藻中有效鐵質量濃度為（7.0 g/kg）。

Garcia MN等人[18]研究了Caco-2細胞是否能夠作為吸收膳食中Fe的細胞模型。更改處理時間、pH值、抗壞血酸等不同的試驗條件，發現當Fe以離子形式存在或含有抗壞血酸時，細胞對Fe的攝取量增加，并且pH值在5.5時攝取量最大，同時研究表明，肉類中的Fe平均攝取量比其他蛋白質來源高近5倍。

Francesca Boato等人[19]研究比較了不同果汁（蘋果汁、梨汁、白葡萄汁、紅葡萄汁、葡萄柚汁、西梅汁和橙汁）在Caco-2細胞單層上對Fe的生物利用度的影響。結果表明，梨汁樣品處理過的Caco-2細胞中Fe蛋白增加最多（1 018%），其次是蘋果汁（455%），橙汁（243%），葡萄柚汁（207%） 和白葡萄汁（196%）。而西梅汁和紅葡萄汁分別使Caco-2細胞中鐵蛋白形成減少了31%和67%。研究結果表明，蘋果汁、梨汁、橙汁、葡萄柚汁和白葡萄汁能夠促進細胞對Fe的生物利用度，紅葡萄汁和西梅汁對Fe的生物利用度有著顯著的抑制作用，這些抑制作用可能是與紅葡萄汁、西梅汁中含有高濃度的酚類化合物有關，因為多酚結合了Fe，從而抑制了Fe的轉運和吸收。

Ariza-Nieto M等人[20]利用Caco-2細胞在體外研究了8種基因型大豆（3種中美洲和5種安第斯山脈）中Fe的生物利用度，測量了子葉、種皮和胚胎中鐵和植酸鹽中Fe的分布。其中，子葉中儲存的Fe含量為71.4%～94.5%，種皮中為4.1%～26.4%，胚胎中為1.1%～3.6%。安第斯基因型G19833全豆Fe含量最高，子葉含鐵最高質量濃度為83 μg/g，最高含Fe質量濃度為146 μg/g；中美洲DOR364，DOR390和安第斯AND696在子葉中鐵的百分比和質量濃度最低。這些結果表明，Fe積累和體外Fe生物利用度在不同的大豆基因型之間是不同的，并且與植酸鹽相比，多酚對Caco-2細胞中Fe的生物利用度具有更大的抑制作用。

除了Fe之外，Carmen等人[21]通過Caco-2細胞單層的吸收率、保留率和運輸效率來評價了3種脫植酸的商業嬰兒谷物對Fe，Ca和Zn生物利用度的影響。試驗表明，嬰兒麥片中的dephytinization顯著提高了Caco-2細胞中Fe的吸收率（從0.66%～6.05%到3.93%～13.00%），保留率（從6.04%～16.68%到14.75%～20.14%），轉運效率（從0.14%～2.21%到1.47%～6.02%）；提高了Zn的吸收效率，從5.00%～35.40%到7.30%～41.60%，保留率從4.05%～20.53%提高到14.45%～61.30%。從大部分樣品中除去植酸鹽后，只有Ca的細胞攝取顯著增加。說明若從嬰兒谷物中脫去植酸鹽，對Fe和Zn的生物利用度有益。從結果可以觀察到，礦物質溶解度與細胞攝取和運輸效率之間呈正相關（p＜0.05）。

上述研究成果說明，基于Caco-2細胞模型可以認識礦物質元素的吸收情況，同時還能了解其他因素存在時對礦物質元素吸收的影響，也可以基于此優化吸收條件，從而提高細胞對礦物質元素的利用率。

2.5 黃酮類

黃酮類化合物分布廣泛、種類繁多，存在于絕大多數植物體內，有著抗菌抗病的功效。利用Caco-2細胞模型可以模擬黃酮類化合物在小腸細胞的吸收代謝情況，從而應用于研發藥品和功能食品中。

2.5.1 黃酮類

Teruaki A等人[22]檢測了黃芩苷和黃芩素在Caco-2細胞單層模型中的吸收和排泄，研究發現，在Caco-2細胞中被攝取的黃芩黃素被葡萄糖醛酸化成黃芩苷，黃芩苷又主要通過多藥耐藥相關蛋白2（MRP2） 從頂端表面排泄。說明低濃度的黃芩素被吸收后并沒有被轉移到基底外側，而是首先在細胞中轉化成黃芩苷并通過MRP2的外排作用，達到達頂端側。

同樣，Ng S P等人[23]研究了黃酮類及黃酮類化合物在Caco-2細胞上的轉運和代謝情況，觀察發現葡糖醛酸化可能是腸壁中類黃酮的主要代謝途徑，并且需要活性蛋白參與，如MRP2和MRP3，而偶聯最有可能發生在所選黃酮的7-OH位置上。黃酮類葡萄糖醛酸苷在Caco-2細胞模型的兩側以降序排列（白楊素＞木犀草素＞芹菜素＞黃芩素），芹菜素和木犀草素葡萄糖醛酸苷含量較高，可能是由于它們有利于7-OH位的親核性。

此外，Miao Q等人[24]研究了Caco-2細胞中的P-糖蛋白（P-gp）的活性和表達受黃芩苷和黃芩素的影響。結果表明，黃芩苷對細胞內Rh-123的積累無明顯影響，幾乎不影響P-gp的表達和維拉帕米的運輸；而黃芩素顯著增加Rh-123的細胞內積累，降低了P-gp的表達并增加維拉帕米的轉運。說明黃芩素可能是一種P-gp抑制劑，對P-gp活性和表達水平有明顯的抑制作用。通過比較黃芩苷和黃芩素的結構，表明葡萄糖基的存在對影響P-gp的活性和表達具有決定性的作用。

另外，Kuntz S等人[25]比較了黃酮類化合物中不同亞類（即異黃酮、黃酮、黃酮醇、黃烷酮）對Caco-2細胞增殖，細胞毒作用及凋亡的影響。研究發現，黃酮類化合物對LLC-PK1和MCF-7細胞凋亡沒有影響，黃芩素和楊梅素能誘導HT-29和Caco-2細胞凋亡。幾乎在所有情況下，黃酮類化合物在沒有細胞毒性的情況下都會出現生長抑制現象，黃酮類化合物在不同的癌細胞系中具有一定的抗增殖作用。

2.5.2 異黃酮類

Murota K等人[26]使用Caco-2細胞單層作為腸上皮模型研究腸類細胞對異黃酮的攝取和代謝情況，研究發現，染料木素比染料木黃酮更有效地被吸收；被攝入的大豆異黃酮也比大豆苷更有效地轉運到腸道Caco-2單層中。結果表明，異黃酮糖苷配基比它們的葡糖苷更有效地攝入腸細胞，因為它們具有適度的親脂性。此外，與類黃酮相比，它們一般以完整的形式轉運至基底外側，異黃酮類比黃酮類更易被吸收，這可能是由于其獨特的異黃酮結構。

Steensma A等人[27]研究了染料木黃酮，大豆黃素及其糖苷在Caco-2細胞上的運輸及代謝情況，處理約6 h后，30%～40%的染料木黃酮和大豆苷元在根尖側被轉運到基底外側，并保持恒定24 h。然而它們的糖苷很難通過Caco-2單層轉運。在Caco-2細胞中沒有發現染料木黃酮和大豆黃素的顯著代謝，而糖苷主要代謝成它們各自的糖苷配基。相關數據表明，內源性糖苷酶在Caco-2細胞中有活性。除此之外，Steensma A等人[28]同樣研究了異黃酮類在Caco-2，IEC-18和HCEC細胞系中的吸收代謝情況，除了以上結論外，在Caco-2和IEC-18細胞中，糖苷被代謝為它們各自的糖苷配基。此外，染料木黃酮和大豆黃素在HCEC細胞中被硫酸化，在Caco-2細胞中被葡萄糖醛酸化和硫酸化，在IEC-18細胞中被葡萄糖醛酸化。

2.5.3 黃酮醇類

槲皮素是黃酮醇類中的研究熱點。Walgren R A等人[29]利用Caco-2細胞模型檢測了槲皮素，槲皮素49-葡萄糖苷和槲皮素3,49-二葡萄糖苷的吸收代謝情況，數據表明槲皮素通過Caco-2細胞時吸收增加；相反，槲皮素49-葡萄糖苷和槲皮素3,49-二葡萄糖苷沒有明顯的吸收，說明槲皮素易被人體腸道上皮細胞所吸收，但它們不支持槲皮素葡萄糖苷的主動轉運過程。此外，Walgren R A等人[30]利用Caco-2細胞模型驗證了MRP2是造成槲皮素49-β-葡萄糖苷不被Caco-2細胞單層吸收的原因，槲皮素49-β-葡萄糖苷的外排不被維拉帕米（一種P-糖蛋白抑制劑） 所改變，但被MRP抑制劑MK-571競爭性地抑制。這些數據與MRP2對頂膜的免疫熒光定位相結合驗證了MRP2在槲皮素49-β-葡萄糖苷的腸跨細胞流出中的作用，即MRP2位于Caco-2細胞的頂端膜，并且該蛋白質限制了槲皮素49-β-葡萄糖苷跨越Caco-2細胞單層的吸收并介導其外排。

Nekohashi M等人[31]研究了木犀草素和槲皮素對Caco-2細胞中膽固醇吸收的影響，在測定前用木犀草素和槲皮素預處理Caco-2細胞，細胞膽固醇攝取顯著降低。結果表明，犀草素和槲皮素通過抑制由NPC1L1介導的腸膽固醇吸收，從而降低Caco-2細胞中的膽固醇水平。

2.6 其他類

目前，國內外在維生素及細菌類方面的營養物質的相關研究較少，維生素類物質在人體和植物體中均含量豐富，對人體有著重要的調節作用，其吸收代謝機制可以成為未來的一個研究方向，因為細菌易培養、生產量大，所以在如何應用于食品方面值得深入研究。

陳佩等人[32]對兩歧雙歧桿菌F-35的發酵上清液、細胞內容物對Caco-2細胞單層中的α-葡萄糖苷酶活性、葡萄糖的轉運及對基因SI，SGLT-1和GLUT-2表達的影響進行了研究。研究表明，兩歧雙歧桿菌F-35對α-葡萄糖苷酶活性、SI，SGLT-1和GLUT-2基因均存在抑制作用，同時也延緩了葡萄糖轉運吸收作用，證明兩歧雙歧桿菌F-35有一定的降血糖作用。張丹丹等人[33]研究了瑞士乳桿菌在Caco-2細胞中的黏附性及其影響因素，研究結果顯示，處于穩定期的瑞士乳桿菌在Caco-2細胞中有很高的黏附性，且當pH值7，處理時間2 h時黏附效果最好。

Liu C S等人[34]研究了胡蘿卜和玉米中的類胡蘿卜素在Caco-2細胞中的吸收情況，結果顯示胡蘿卜素和玉米黃質的Caco-2細胞攝取高于葉黃素。Caco-2細胞對食物中類胡蘿卜素的攝取量均呈曲線變化，孵育4 h后達到飽和水平，并且試驗數據表明熟玉米粒顯著增強了類胡蘿卜素的生物利用度，即烹飪過程提高了玉米類胡蘿卜素的生物利用度。

3 結語

縱觀目前國內外基于Caco-2細胞模型在食品營養領域中的研究報道，主要圍繞食品多肽類、多糖類、多酚類、黃酮類、礦物元素類及其他類（維生素、脂質類等）展開，主要研究了各種食品營養物質在Caco-2細胞中的生物利用率，轉運機制或是其他因素對于轉運機制的干擾（促進或抑制）作用。但在其他類別營養物質共存和不同外在因素對小腸上皮細胞吸收營養物質的研究較少，而且在食品營養物質的安全性方面研究也較少。為了進一步將食品營養物質的中的營養效能發揮到極致，未來可以充分利用Caco-2細胞模型，借助于分子生物學、系統生物學、代謝組學等多組學技術，系統地針對食品營養物質的吸收機制進行研究。為開發高品質功能食品、提高食品營養物質的吸收率，深入認識食品營養物質的吸收機制作出新的貢獻。

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