siRNA下調Gli基因影響食管腺癌OE33細胞生長轉移的實驗研究*

王雷，杜媛鯤，劉慶熠，米源，廖海江，王林

（1.河北醫科大學第四醫院 胸二科，河北 石家莊 050011；2.河北醫科大學 期刊社，河北 石家莊 050017）

食管癌的發病率在全球所有惡性腫瘤中居第8位，其中我國是食管癌高發區。食管癌的病理類型主要包括鱗癌和腺癌，盡管近30年來鱗癌發病率呈下降趨勢，但食管腺癌發病率上升了3～4倍，并且多數患者確診時即為進展期，即使采用根治性手術聯合放化療等綜合措施，5年生存率任然＜20%[1-2]。異常激活的Hedgehog（以下簡稱Hh）信號傳導通路在惡性胸膜間皮瘤、淋巴瘤、肺癌、前列腺癌的增殖、侵襲及遷移中發揮重要作用[3-5]。既往針對食管腺癌Hh通路的研究多集中在上游靶點Smo，針對Hh通路下游核心靶點Gli1、Gli2的表達調控與食管腺癌生物學行為關系的研究極少，所以本研究通過siRNA抑制Gli1和Gli2在食管腺癌OE33細胞中的表達，探討Gli表達下調對食管腺癌細胞生長和侵襲能力的影響，以及可能的分子機制，旨在為臨床上食管腺癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系來源 人食管腺癌細胞系OE33購自英國Sigma-Aldrich公司，

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（美國Gemini公司），RPMI 1640培養液（美國Corning公司），Silencer?Select Gli1、Gli2和Control siRNA購自美國Life Technologies公 司，Lipofectamine? RNAiMAX轉 染試劑（美國Invitrogen公司），總RNA提取試劑盒（德國Qiagen公司），TaqMan?基因表達預混液（美國 Applied Biosystems公 司 ），iScript? cDNA 合 成試劑盒（美國 Bio Rad公司），TaqMan? Gli1引物和探針（Hs00171790）、TaqMan? Gli2引物和探針（Hs01119974_m1）、TaqMan?甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Hs02758991_g1）購自美國Life Technologies公司，Pierce-BCA蛋白分析試劑盒（美國Thermo Scientific公司），Gli2鼠抗人單克隆抗體、p27鼠抗人單克隆抗體、GAPDH鼠抗人單克隆抗體及N-cadherin兔抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，Gli1兔抗人多克隆抗體和E-cadherin鼠抗人單克隆抗體購自美國abcam公司，Cyclin D1兔抗人單克隆抗體（美國Cell Signaling公司），增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（美國Thermo Scientific公司），Matrigel膠和Transwell膜嵌套購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 食管腺癌OE33細胞培養于10%胎牛血清的RPMI 1640培養基。將呈對數生長期的OE33細胞以3×105個/孔接種于6孔板上，第2天待細胞融合生長達50%～60%時更換無血清培養基，并按照Lipofectamine? RNAiMAX轉染試劑說明書進行Gli1和Gli2 siRNA干擾引物的轉染，同時設立對照組（Control siRNA）。每組各設3個孔，轉染時每孔Gli1和Gli2 siRNA，以及對照組的濃度均為100 nmol/L，于轉染6 h后更換新的培養基，48 h后PBS洗滌細胞3次，提取各組樣本的mRNA和蛋白，實驗重復3次。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR） ① 總RNA的提?。喊凑湛俁NA提取試劑盒說明書提取各組樣本RNA,并測定每組樣本RNA濃度。②cDNA合成：按照iScript? cDNA合成試劑盒說明書進行cDNA的逆轉錄，每份樣本的反應體系為40μl，包含iScript逆轉錄酶 2μl，iScript反應混合液 8μl和總RNA 500 ng，放置于Veriti? 96-Well Thermal Cycler儀器中進行cDNA的逆轉錄。逆轉錄條件：25℃變性5 min，42℃退火30 min，85℃延伸5 min。③PCR擴增：將每份樣本的cDNA用無R-Nase水稀釋10倍，在384孔板按照10μl/孔的反應體系將每組樣本Cdna 4.5μl、Taqman基因表達預混液5μl，以及TaqMan?Gli1、Gli2、GAPDH各自的引物和探針0.5μl依次加在孔里，2 000 r/min離心2 min，置于ABI 7900HT高通量qRT-PCR儀中進行PCR擴增。PCR擴增條件：95℃預變性10 s，60℃變性10 s，72℃退火10 s，共40個循環。以GAPDH的Ct值作為內參，采用2-ΔCt法進行樣本分析。

1.2.3 Western blot檢測 用PBS洗滌3次轉染48 h細胞，每個6孔板內加含有蛋白酶抑制劑的M-PER細胞總蛋白提取試劑100μl，收集每組樣本的總蛋白提取液，聚氰基丙烯酸正丁酯法測定樣本的總蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，工作條件200 V、50 min。冰浴下100 V、1 h轉至聚偏氟乙烯膜。室溫5%脫脂奶粉的TBST液封膜1 h，剪膜分別加入一抗Gli-1（1:1 000）、一抗 Gli2（1:250）、一抗 Cyclin D1（1:1 000）、一抗 N-cadherin（1:500）、一抗 p27（1:250）、一抗E-cadherin（1:10 000）及一抗 GAPDH（1:10 000），4℃搖床孵育過夜。第2天TBST洗膜3次，10 min/次，分別加入羊抗鼠或羊抗兔二抗（1:20 000）室溫孵育1h，ECL試劑發光5 min后暗室曝光顯影，Image軟件檢測蛋白條帶的表達。設定GAPDH為內參，每組樣本的蛋白相對表達量=目的蛋白表達量/內參蛋白表達量。實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞術 流式細胞術檢測細胞周期變化。將轉染48 h后的OE33細胞制備成單細胞懸液，PBS漂洗后置于4℃、70%冰乙醇固定30 min。用冷PBS漂洗3次，重懸細胞于含40μg碘化丙啶和100μg RNaseA的PBS中37℃孵育30 min。上機檢測各組樣品的DNA含量，采用Muticycle AV分析軟件對DNA細胞周期進行擬合分析。實驗重復3次。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 將鋪好Matrigel基質膠的聚碳酸酯膜平鋪于Transwell小室的下室。收集轉染后的OE33細胞重懸于無血清培養液中，吹打為單細胞懸液，加入Transwell小室上室（100μl/室），包含7.5×104個細胞。下室加入含10%血清的培養液（500μl/室），37℃、5%二氧化碳CO2培養24 h，用棉棒擦去上層基質膠和未遷移的細胞，將聚碳酸酯膜用甲醇固定，結晶紫染色。倒置顯微鏡下高倍視野（400倍）觀察穿膜細胞數。每張膜隨機取4個視野并計算平均值。實驗重復3次。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Gli1和Gli2基因的表達

Gli1和Gli2 siRNA組Gli1 mRNA表達水平為（0.18±0.32），與對照組（1.00±0.06）比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=20.300，P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA組較對照組降低。Gli1和Gli2 siRNA組Gli2 mRNA表達水平為（0.30±0.03），與對照組（1.00±0.05）比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=20.590，P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA組較對照組降低。見圖1。

2.2 Gli1、Gli2、Cyclin D1、p27、E-cadherin及N-cadherin蛋白表達

Gli1和 Gli2 siRNA組 Gli1、Gli2、Cyclin D1及N-cadherin蛋白表達與對照組比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=25.579、35.340、14.950和14.230，均P=0.000），Gli1和Gli2siRNA組較對照組減少。Gli1和Gli2 siRNA組E-cadherin、p27蛋白表達與對照組比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=-75.714和-19.864，均P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA組較對照組增加。見圖2。

2.3 Gli1和Gli2 siRNA對細胞周期的影響

圖1 兩組Gli1和Gli2 mRNA的表達比較

圖2 兩組Gli1、Gli2、Cyclin D1、p27、E-cadherin及N-cadherin蛋白的表達

Gli1和Gli2 siRNA組G0/G1期細胞為（64.47±3.14）%，對照組為（39.07±2.20）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=-11.480，P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA組增高。Gli1和Gli2 siRNA組S期細胞為（25.03±1.50）%，對照組為（58.40±3.34）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=15.768，P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA組降低。見圖3。

圖3 流式細胞術檢測結果

2.4 Gli1和Gli2 siRNA對細胞侵襲能力的影響

Gli1和Gli2 siRNA組相對穿膜細胞數為（0.49±0.06），對照組為（1.00±0.09），經t檢驗，差異有統計學意義（t=8.622，P=0.001），Gli1和Gli2 siRNA組穿膜細胞數減少。見圖4。

圖4 Gli1和Gli2 siRNA對細胞侵襲能力的影響

3 討論

Hh信號通路主要由Hh配體、跨膜蛋白受體Ptch、Smo、核轉錄調控子Gli及下游靶基因等構成，其通路的異?；罨谀[瘤形成、侵襲及轉移中發揮重要作用，針對其通路的靶向抑制也成為抗腫瘤治療的熱點。目前針對Hh通路的調控多集中在Smo，由于存在不依賴Smo激活的非經典Hh通路、Hh通路，以及TGFβ、EGFR等通路存在交叉調控，因此針對Hh信號通路的下游核轉錄因子Gli調控起到更好的抗腫瘤效果。Gli包括Gli1、Gli2及Gli3 3種形式，其中Gli3是轉錄抑制因子，而Gli1和Gli2具有轉錄激活作用[6]。活化的Gli1和Gli2進入細胞核與下游基因啟動子區結合，并調控靶基因的轉錄，促進細胞增殖和上皮間質轉化，抑制細胞凋亡等，從而導致腫瘤的發生、發展。近年來，基因治療作為一種全新的治療模式顯示出良好的應用前景，其中RNA干擾被公認為是細胞調節基因表達的關鍵機制。本研究應用siRNA下調人食管腺癌細胞OE33的Gli1和Gli2表達，觀察其抗腫瘤效果。實驗結果顯示，轉染Gli1和Gli2 siRNA 48 h后，OE33細胞中內源性Gli1、Gli2 mRNA和蛋白表達下調，低于對照組，提示特異性的Gli1和Gli2 siRNA能下調食管腺癌細胞中內源性Gli1、Gli2的表達。

細胞周期紊亂與腫瘤的發生密不可分，當細胞的增殖能力增強且對正常負性調節的刺激變弱，可導致腫瘤發生。本研究應用流式細胞術分析轉染Gli1和Gli2 siRNA后，OE33細胞的周期分布變化。結果顯示，與對照組相比，Gli1和Gli2 siRNA組可將更多細胞阻滯于G0/G1期，從而控制腫瘤細胞的增殖。為進一步探討食管腺癌細胞Gli表達和周期變化的可能機制，筆者對細胞周期相關蛋白的表達進行檢測。Cyclin D1是細胞周期的關鍵因子也是原癌基因，其可以和CDK4、CDK6形成cyclin D/CDK復合物，促進細胞由G1期進入S期，加速細胞的增殖，與多種腫瘤的發生、發展有關[7-8]。此外Cyclin D1也被證實可作為Hh通路的靶基因，被活化的Hh通路所調節[9]。p27能夠通過抑制CDK復合物，調節細胞周期，抑制細胞由G期進入S期，當p27表達下降或缺失時，可誘發細胞增殖失控，導致腫瘤發生[10]。關于食管腺癌Hh/Gli信號通路與Cyclin D1、p27的關系未有明確報道。本研究發現，Gli1和Gli2表達沉默后Cyclin D1蛋白的表達下降，p27上調，表明Hh/Gli信號通路激活后，誘導細胞惡性轉化的途徑之一可能是通過調節Cyclin D1和p27表達對細胞周期進行調控。

上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，以上皮表型標志E-Cadherin下調，N-Cadherin和Vimentin等間質表型特征分子表達上調為特征，是腫瘤細胞獲得侵襲與轉移能力的有效方式之一[11-12]。YUE等[13]研究發現，活化Hh信號通路可以調控EMT過程，促進肺癌的侵襲、轉移，而應用Gli抑制劑可以通過上調E-Cadherin表達來抑制肺癌細胞侵襲。本研究結果表明，抑制Gli1和Gli2表達后，E-Cadherin表達上調，N-Cadherin表達下調，Transwell實驗進一步表明，Gli1、Gli2表達沉默后，穿膜細胞數減少，究其原因可能是Hh/Gli通路通過誘導食管腺癌細胞的EMT過程，促進侵襲、轉移，而敲掉Gli1和Gli2基因可以通過抑制腫瘤細胞的EMT進程，從而降低腫瘤細胞的侵襲能力。

本研究結果提示，Gli有可能在食管腺癌的發生、發展中發揮重要作用，下調Gli表達可以抑制食管腺癌細胞的生長、增殖及侵襲，針對Hh/Gli通路的抑制劑有望成為臨床上治療食管癌的有效措施之一。

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