KRT19基因多態性對化療聯合靶向治療NSCLC療效的影響

周小果

（河南省南陽市中心醫院 呼吸內科，河南 南陽 473000）

肺癌的致死率和發病率居全球惡性腫瘤的首位，其中非小細胞肺癌（non-small cell carcinoma，NSCLC）占肺癌的80%[1]。目前治療NSCLC的方法有手術、化療、放療等。研究表明，NSCLC患者根治術后行化療，能延長患者生存時間。臨床研究證實，細胞角蛋白19片段（keratin 19，KRT19）為肺癌腫瘤標志物[2]。目前化療聯合分子靶向治療對晚期NSCLC患者生存時間的影響，以及KRT19基因多態性與化療聯合靶向治療預后的關系研究較少。本研究旨在探討KRT19（-99G＞C）基因多態性與化療聯合靶向治療療效的相關性，為臨床治療晚期NSCLC提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2010年4月-2012年4月在河北省南陽市中心醫院呼吸內科接受外科根治術后行化療聯合靶向治療的晚期NSCLC患者146例。其中，男性93例，女性53例；年齡51～75歲，中位年齡61歲，有吸煙史患者78例，按照國際抗癌聯盟肺癌TNM分期標準分為：Ⅲa期52例，Ⅲb期53例，Ⅳ期41例；鱗癌82例，腺癌64例。美國東部腫瘤協作組的功能狀態評分≤2分。患者在化療聯合靶向治療前，血常規和腎功能均在正常范圍內，心電圖正常，體力狀況（Karnofsky，KPS）評分≥70分。納入標準：①經手術或穿刺活檢病理證實，有可評估的病灶，且無其他部位腫瘤；②首次接受化療聯合靶向治療方案，治療前無血常規、肝腎功能異常，心電圖正常；③患者依從性好，簽訂知情同意書，愿意接受術后隨訪。排除標準：①合并有嚴重的肝腎功能或造血系統疾病；②嚴重心腦血管疾病或精神疾病；③依從性差或不愿接受隨訪。

1.2 治療方案

146例患者采用化療聯合尼妥珠單抗靶向治療。化療方案依據患者肺癌細胞類型及全身狀況制定，主要采用順鉑DDP或卡鉑CBP方案為主的化療，其中18例患者采用DDP或CBP聯合伊立替康治療；51例患者采用DDP或CBP聯合吉西他濱治療；32例患者采用DDP或CBP聯合去甲長春堿治療；30例患者采用DDP或CBP聯合紫杉醇聯合治療；15例患者DDP聯合培美曲塞二鈉聯合治療。具體用藥劑量為：第1天，DDP 75 mg/m2或者CBP曲線下面積5～6 g；第1和8天，吉西他濱1 250 mg/m2；第1天，紫杉醇135～175 mg/m2維持≥3 h；第1和8天，去甲長春堿25 mg/m2；第1天，培美曲塞二鈉500 mg/m2。在化療治療的基礎上聯合尼妥珠單抗治療，尼妥珠單抗200 mg靜脈滴注，1次/周，連續用藥6周，6周后改為1次/2周。21 d為1個治療周期，治療4個周期。

1.3 近期療效評估

根據美國國立癌癥研究所制定的有關實體瘤的療效評定標準，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、穩定（stable disease，SD）和進展（progressive disease，PD）。以CR+PR，且持續時間≥24周為臨床有效。對化療聯合靶向治療有效且病灶穩定的患者，采取停止化療和尼妥珠單抗靶向治療，進入觀察隨訪時間，若出現新的病灶則需要進行二線治療。患者生存時間指確診為肺癌至患者死亡或末次隨訪時間，隨訪截止時間為2016年5月23日。隨訪采用電話咨詢或者門診隨訪。

1.4 方法

1.4.1 外周血標本及DNA提取 采集癌癥患者外周靜脈血5 ml，置于含EDTA的真空管中，-80℃冰箱中保存。取血樣標本2 ml，采用基因組DNA快速提純試劑盒（美國Promega生物試劑公司）提取DNA，保存于-40℃冰箱中備用。

1.4.2 PCR-RFLP應用 引物設計參照文獻[1]，由上海英駿生物科技工程有限公司合成。采用Light Scanner Primer Design軟件設計KRT19（-99G＞C）基因相應位點引物，均采用小片段擴增引物。KRT19（-99G＞C）（C）正向引物：5’-CCGGTACATGGCCTATTAACGTGCATACGG -3’，反向引物：5’-CGTTGCGCAATGCTGACCGATCA-3’，PCR產物片段長度168 bp。

1.4.3 目的基因擴增 PCR擴增體系為25 ml，其中含5 ml PCR Mix，正反向引物各0.5 ml，1 ml LC Green和1 ml DNA模板，剩余加入雙蒸水。KRT19（-99G＞C）的擴增反應條件為：95℃預變性2 min，93℃變性30 s，55℃退火30 s，73℃延伸45 s，93℃變性 45 s，45℃退火30 s，共40個循環，72℃繼續延伸5 min，限制性內切酶為RsaⅠ。取PCR產物10μl于37℃酶切2 h，在含2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，紫外線透射儀觀察PCR擴增是否成功，鑒定其特異性。全部測序由ABI3100測序分析儀（美國ABI公司）完成。為準確測定基因分型結果，隨機選取10%樣本采用直接測序法進行驗證。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計數資料以率表示，基因型頻率的觀察值與預期值行χ2檢驗及Hardy-Weinberg平衡分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，各因素水平間采用Log-rank檢驗，影響死亡的因素采用Cox比例風險模型分析，均校正患者的性別、臨床分期、病理類型、PS評分及化療方案。統計學檢驗結果均為雙側概率檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KRT19（-99G＞C）基因頻率

經限制性內切酶剪切后，KRT19（-99G＞C）存在3種基因型，其中GG型酶切產物片段大小為168 bp；GC型酶切產物片段大小為168、135和65 bp；CC型酶切產物片段大小為135和65 bp。PCR檢測結果顯示，GG型基因頻率為21.92%（32/146），GC型為40.41%（59/146），CC 型為 37.67%（55/146）。見圖1。

2.2 KRT19（-99G＞C）基因平衡檢測

應用 Hardy-Weinberg定律對KRT19（-99G＞C）基因型分布行遺傳平衡檢測，KRT19（-99G＞C）位點的檢測結果比較，差異無統計學意義（χ2=2.147，P=0.112），該樣本來自同一孟德爾群體，符合遺傳平衡。

2.3 臨床因素與化療聯合靶向治療敏感性的關系

性別、年齡、吸煙史、臨床分期、病理類型、組織學分級及KPS評分對晚期NSCLC患者化療聯合靶向治療的敏感性無明顯影響（P＞0.05）。見表1。

2.4 KRT19（-99G＞C）基因多態性與化療聯合靶向治療療效的關系

GG基因型患者與GC+CC基因型患者化療聯合靶向治療的有效率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；攜帶C基因型者對化療聯合靶向治療的敏感性是T基因型的1.897倍。見表2。

2.5 KRT19（-99G＞C）基因多態性與生存率的相關性

至隨訪截止時間，146例晚期NSCLC患者中死亡67例，無失訪者，治療后中位生存時間（middle survival time，MST）為 22.1個月。KRT19（-99G＞C）等位基因C攜帶者（GC+CC）的MST短于GG基因型攜帶者（P＜0.05）。見表3和圖2。

2.6 Cox模型多因素分析

化療聯合靶向治療、KRT19（-99G＞C）變異等位基因C是影響晚期NSCLC患者預后的獨立危險因素，其變異等位基因C攜帶者（GC+CC）的是GG基因型攜帶者的2.014倍（P＜0.05）。見表4。

圖1 KRT19（-99G＞C）基因多態位點的瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 臨床因素與晚期NSCLC患者化療聯合靶向治療敏感性的關系 （%）

表2 KRT19（-99G＞C）基因多態性與化療聯合靶向治療療效的關系 例（%）

表3 KRT19（-99G＞C）基因多態性與生存率的關系

圖2 KRT19（-99G＞C）基因多態性患者的生存曲線

表4 晚期NSCLC患者預后影響因素的Cox多因素回歸分析參數

3 討論

NSCLC是全球范圍內死亡率和致死率最高的惡性腫瘤之一，多數患者確診時已屬晚期，失去最佳手術時機，因此多需要進行內科治療為主的綜合治療。鉑類藥物聯合吉西他濱、紫杉醇或長春見等藥物進行化療是主要標準方案，但有效率僅為30%左右，同時個體差異等不同化療效果也不盡相同[3-4]。近年來，分子靶向治療正逐漸受到重視，其對可能導致細胞變惡環節，如原癌基因和抑癌基因失衡、腫瘤血管異常增生、細胞信號傳導通路等，選擇具有針對性、有效性的阻斷劑，能夠從分子水平阻止或者逆轉這種正常細胞的惡變，從而能夠抑制腫瘤生長、復發或轉移[5]。本研究中化療藥物不同，主要是針對不同患者體質，采取相應化療方案。而分子靶向治療藥物選擇的是尼妥珠單抗，為人表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的人源化單克隆抗體，能夠抑制EGFR在腫瘤發生、發展中發揮生物學作用，而EGFR被認為與NSCLC的發生、發展密切相關[6]。越來越多的學者采用尼妥珠單抗聯合常規化療的方案，來治療晚期NSCLC患者，結果顯示，尼妥珠單抗不僅能夠通過阻斷EGFR，來抑制癌細胞的惡性生物學行為，同時可以增加癌細胞對化療藥物的敏感性[7]。這也是本研究采用化療聯合靶向治療NSCLC的主要原因。另有研究表明，尼妥珠單抗聯合常規化療方案治療晚期NSCLC患者的CR、PR、SD比例高于常規組[8]。

KRT19是一種分化特異的蛋白質，廣泛存在于上皮細胞，是一種重要的肺癌腫瘤標志物，對NSCLC具有重要的診斷價值，根據其分子質量及雙向電泳等特點分析顯示，其有2個亞群，1個是酸性蛋白、1個為堿性蛋白[9]。有報道指出，尼妥珠單抗聯合三維適形放射治療晚期NSCLC能夠降低KRT19含量，此外KRT19與 EGFR 具有相關性[10]。KRT19（-99G＞C）位于KRT19基因外顯子區域內。有報道指出（-99G＞C）基因位點G等位基因突變為C基因后，肺癌發生率顯著增加[11]。本研究結果顯示，KRT19（-99G＞C）等位基因C攜帶者（GC+CC）的MST短于GG基因型攜帶者；Cox模型基因分析發現，KRT19（-99G＞C）變異等位基因A攜帶者（GC+CC）的OR是GG基因型攜帶者的2.014倍，表明KRT19（-99G＞C）基因多態性影響化療聯合靶向治療的敏感性。需要指出的是，以往研究發現化療治療晚期NSCLC患者的MST在8～12個月[12-13]，而本研究發現化療聯合靶向治療晚期NSCLC患者MST在22個月左右，患者生存時間延長。

綜上所述，KRT19（-99G＞C）位點基因多態性是影響晚期NSCLC患者化療聯合靶向治療預后的獨立危險因素，且與化療聯合靶向治療敏感性相關。

[1] SIEGEL R, NAISHADHAM D, JEMAL A. Cancer statistics,2012[J]. CA Cancer J Clin, 2012, 62(1): 10.

[2] LIN J C, CHEN K Y, WANG W Y, et al. Evaluation of cytokeratin-19 mRNA as a tumor marker in the peripheral blood of nasopharyngeal carcinoma patients receiving concurrent chemoradiotherapy[J]. Int J Cancer, 2002, 197(4): 548-553.

[3] FUJITA J, DOHMOTO K, HOJO S, et al. The point mutation in the promoter region and the single nucleotide polymorphism in exon 1 of the cytokeratin 19 gene in human lung cancer cell lines[J]. Lung Cancer, 2001, 34(3): 387-394.

[4] GALVANI E, PETERS G J, GIOVANNETTI E. EGF receptortargeted therapy in non-small-cell lung cancer: role of germline polymorphisms in outcome and toxicity[J]. Future Oncol, 2012,8(8): 1015-1029.

[5] HUANG W F, LIU A H, ZHAO H J, et al. BIM Gene polymorphism lowers the efficacy of EGFR-TKIs in advanced nonsmall cell lung cancer with sensitive EGFR mutations: a systematic review and meta-analysis[J]. Medicine (Baltimore), 2015, 94(33), DOI:10.1097/MD. 0000000000001263.

[6] ADJEI A A, SALAVAGGIONE O E, MANDREKAR S J, et al.Correlation between polymorphisms of the reduced folate carrier gene (SLC19A1) and survival after pemetrexed-based therapy in non-small cell lung cancer: a north central cancer treatment groupbased exploratory study[J]. J Thorac Oncol, 2010, 5(9): 1346-1353.

[7] DY G K, MANDREKAR S J, NELSON G D, et al. A randomized phase II study of gemcitabine and carboplatin with or without cediranib as first-line therapy in advanced non-small-cell lung cancer: north central cancer treatment group study N0528[J]. J Thorac Oncol, 2013, 8(1): 79-88.

[8] ARAUJO L H, TIMMERS C, BELL E H, et al. Genomic characterization of non-small-cell lung cancer in african americans by targeted massively parallel sequencing[J]. J Thorac Oncol,2015, 33(17): 1966-1973.

[9] HEIST R S, CHRISTIANI D. EGFR-targeted therapies in lung cancer: predictors of response and toxicity[J]. Pharmacogenomics,2009, 10(1): 56-68.

[10] NIE Q, WANG Z, ZHANG G C, et al. The epidermal growth factor receptor intron1 (CA) n microsatellite polymorphism is a potential predictor of treatment outcome in patients with advanced lung cancer treated with Gefitinib[J]. Eur J Pharmacol,2007, 570(1/2/3): 171-175.

[11] HAGHGOO S M, ALLAMEH A, MORTAZ E, et al.Pharmacogenomics and targeted therapy of cancer: focusing on non-small cell lung cancer[J]. Eur J Pharmacol, 2015, 754: 82-91.

[12] PANG L, WANG J, JIANG Y, et al. Decreased levels of serum cytokeratin 19 fragment CYFRA 21-1 predict objective response to chemotherapy in patients with non-small cell lung cancer[J].Exp Ther Med, 2013, 6(2): 355-360.

[13] TANAKA K, HATA A, KAJI R, et al. Cytokeratin 19 fragment predicts the efficacy of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor in non-small-cell lung cancer harboring EGFR mutation[J]. J Thorac Oncol, 2013, 8(7): 892-898.