組織工程骨激活低氧誘導因子HIF-1α促進骨修復

鄧正煒，張亞東，趙世昌

(1.上海中醫藥大學，上海 200120；2.上海健康醫學院附屬第六人民醫院南院骨科，上海 201400；3.上海市第六人民醫院骨創傷外科，上海 200030)

低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是組織細胞在低氧狀態下激活相應基因轉錄的核心調節因子之一，在骨發育和代謝過程中起到十分關鍵的作用。現將激活HIF1-α信號通路的方法、作用機制和潛在應用價值加以綜述。

1 低氧誘導因子-1α與骨代謝

組織細胞缺血、缺氧狀態下表達的HIF-1α是誘導低氧基因和維持細胞內氧環境穩定的核心轉錄因子，參與調控血管生成、炎性細胞及干細胞歸巢、細胞分化、糖代謝等眾多生理病理反應[1]。機體內多數組織器官在生理條件下都維持20%左右的氧分壓，而骨骼及骨髓腔處的低氧狀態的氧分壓只有1%～7%，因此骨骼內的多種細胞在生理狀態下都表達為HIF-1α[2]。HIF-1α通過調控下游的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、促血管新生蛋白因子-2(angiopoietin-2)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，FGFs)等一系列靶標因子從而實現對血管形成過程進行調控。在正常氧分壓的情況下，HIF-1α被低氧誘導因子脯氨酰羥化酶(hypoxia inducible factor proline hydroxylase，HIF-PH)羥基化，從而使其泛素化并降解，在缺氧情況下，HIF-PH被抑制使得HIF-1α在細胞內積累進而調節細胞的生命活動。常規HIF-PH抑制劑可以抑制HIF-PH活性進而激活HIF-1α促進細胞的募集、分化和血管形成[3]。

首先，HIF-1α高表達可以提供良好的血供和充分的氧氣，促進VEGF的表達從而促進血管的生長，也有利于促進骨生長的部分細胞增殖和生長因子的分泌。HIF-1α對血管誘導作用和對干細胞歸巢引導作用具有強控制力，可以從根本上改善骨折周圍軟組織的生長條件。HIF-1α在低氧信號中是一個關鍵的轉錄因子，能夠增加和調節氧含量和營養代謝從而維持能量和氧化還原平衡[4]。同時，激活HIF-1α促進骨代謝的臨床和動物模型中，組織工程骨(tissue engineering bone，TEB)因其特性突出、可修飾性強等特點而廣泛被研究應用[5]。目前，常見的激活HIF-1α通路的方法包括：HIF-PH抑制劑植入、基因干預、材料功能性(孔徑大小、表面修飾、組織相容性、生物降解性[6]、力學強度等)改造、3D打印技術和中醫藥干預等。

2 激活HIF-1α通路促進骨修復在骨組織工程中的應用

激活HIF-1α通路可以促進骨代謝及骨修復。激活HIF-1α最常見的方法為使用HIF-PH抑制劑，它們包括CoCl2、去鐵胺(deferoxamine，DFO)[7]、二甲基乙二酰氨基乙酸(dimethyloxallyl glycine，DMOG)、含羞草素(L-mimosine，L-mim)[8]等。目前研究顯示，銅離子植入、基因的敲低或過表達、組織工程骨的加工和藥物添加等方式均可一定程度上提高HIF-1α表達。激活HIF-1α的方法包括以下幾類。

2.1 HIF-PH抑制劑

2.1.1 鈷離子(Co2+) 介孔生物活性玻璃(mesoporous bioactive glass，MBG)添加鈷離子(Co2+)可以激發支架對低氧做出反應。Quinlan等[9]將MBG分別與鈷(Co2+)一起并入玻璃網絡中制備了復合型Co2+/MBG/膠原蛋白-粘多糖支架，能顯著增強VEGF的生成和表達進而促進血管形成。Wu等[10]研究發現Co-MBG復合生物支架顯著提高了VEGF蛋白的分泌，提高了HIF-1α、骨相關基因在骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)中的表達，促進了BMSCs的附著和增殖。同時Co2+肌肉注射也可以激活生命體對低氧做出反應[11]。Huang等[12]用CoCl2/生理鹽水腹膜全身給藥處理脛骨骨折的大鼠，發現CoCl2顯著促進骨折愈合、提高機械強度并增強骨折活體修復——CoCl2處理大鼠的HIF-1α、VEGF、runt相關的轉錄因子2(runt-related transcription factor，2RUNX2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)在mRNA/蛋白質水平表達提高。各類研究表明，Co2+可以通過抑制HIF-PH活性進而顯著提高血管生成基因、成骨基因表達和OCN、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的分泌以及類管狀細胞網絡的形成，從而促進骨修復。

2.1.2 DFO DFO作為常用的HIF-PH抑制劑，體內和體外均可以在不依賴氧濃度的條件下提高HIF-1α表達，促使機體對低氧作出反應。Chen等[13]研究表明，大部分水凝膠纖維支架可在14d內降解完全，并可持續釋放DFO 72h，DFO通過Fe2+螯合物作用減弱HIF-PH活性，使得HIF-α表達上調明顯增加新血管化、細胞增殖和血管形成。Li等[14]將成熟雄性激素性股骨頭壞死(steroid-induced necrosis of the femoral head，ONFH)新西蘭白兔隨機分為雙側核減壓組、局部DFO給藥組和對照組，發現DFO組的HIF-1α、VEGF、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、OCN的表達都較其他組高，改善了新生骨體積和血管分布。Jia等[15]將含有DFO的聚乳酸羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)支架移植到嚴重骨質疏松性股骨缺損/正常人中，發現DFO增強了MSCs的成骨分化，上調了MSCs中血管生成因子的mRNA表達水平，促進了人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的血管生成——DFO通過激活HIF-1α信號通路可促進MSCs的成骨分化和血管生成從而加速骨質疏松性骨缺損的愈合。總之，DFO能夠通過Fe2+螯合物作用減弱HIF-PH活性，使得HIF-α表達上調，進一步促進骨修復。

2.1.3 DMOG DMOG能顯著增強骨相關基因的表達并促進血管生成活性。Zhu[16]和Ding[17]等發現DMOG通過激活HIF-1α的表達，顯著地增加了脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)中VEGF的生成，并提高了ADSCs的成骨分化潛能，增強了ADSCs的血管生成和成骨活性，明顯改善了壞死區的血管化和骨再生。Woo等[18]在MC4前成骨細胞中發現，DMOG和丁酸合成產物協同增強前成骨細胞應答和成骨細胞分化，加速骨再生的過程——這主要與α硫酸鈣增加了HIF-1α、VEGF、BSP等表達相關。Zhang等[19]在DMOG處理的人類誘導多能干細胞中發現持續激活的HIF-1α，顯著增強了人類多功能干細胞-MSCs(human pluripotent stem cells，hiPSC-MSCs)中血管生成相關因子的基因和蛋白表達，這主要與DMOG通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B通路有關。類似地，Peng等[20]發現DMOG增強了MSC成骨分化通過激活HIF-1α從而激活Wnt/β-catenin信號通路來實現。總之，DMOG能夠在MBG支架中抑制HIF-PH活性，顯著誘導HIF-1α、VEGF和骨相關基因表達，從而促進骨修復。

2.1.4 L-mim L-mim是HIF-PH抑制劑，可以激活HIF-1α通路，從而提供良好的血供和充分的氧氣，促進VEGF、成骨相關細胞的表達，進而有效促進骨組織修復。Janjic等[21]對人類牙髓原代細胞進行單層、球狀培養來探討L-mim對牙髓再生的影響，發現L-mim通過激活HIF-1α增加了血管生成素樣4(angiopoietin-like 4，Angptl4)、血管生成素在蛋白水平的合成和Angptl4在mRNA水平的表達。Warnecke等[22]在血管生成的海綿模型中，局部反復注射L-mim可顯著增加組織由邊緣向中心血管化的趨勢，體外和體內試驗均說明了L-min可通過影響林希氏基因(von Hippel-Lindau，pVHL)來誘導激活HIF-1α促進血管化進而快速適應缺氧環境，為缺損骨組織局部提供良好的血供及營養，可以有效促進骨修復。

2.1.5 銅離子(Cu2+)及其化合物 銅、鈷作為第八元素具有類似的化學性質，Cu2+是否具有與Co2+相似的性質引起了廣泛關注。Wu等[23]將Cu2+植入大孔和有序中間孔道的MBG中，制備了兩種Cu-MBG支架。在人類BMSCs中，發現兩種Cu-MBG和它們的離子萃取物均可以刺激HIF-1α和VEGF表達；并改善ALP、OPN和OCN等的表達，促進了人類BMSCs的成骨分化。Zhang等[24]采用粒徑約30納米的結晶氧化銅/氧化亞銅納米離子得到水溶性石墨烯氧化銅納米復合材料(GO-Cu)，并將GO-Cu作用于覆蓋多孔的磷酸鈣支架，制備了表面分布均勻、持續釋放Cu2+的復合支架。體外實驗表明，GO-Cu涂層增強了大鼠BMSCs的附著力和成骨分化；并通過激活細胞外信號調節酶1/2信號通路上調BMSCs中HIF-1α的表達，從而促進VEGF和BMP-2的分泌，增加了血管生成和成骨形成，進一步促進骨修復。

2.1.6 其他金屬離子及其化合物 Xiang等[25]采用鈰氧化物納米顆粒(cerium oxide nanoparticles，CNPs)修飾TEB支架，發現CNPs可以提高細胞增殖和抑制細胞凋亡。細胞膜與納米粒子表面相互作用可以激活MSCs的鈣通道，提高細胞內游離Ca2+含量，增強了HIF-1α的穩定性，進而加強VEGF表達。同時，VEGF旁分泌可以促進內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的增殖、分化和管腔形成，顯著改善TEB體內的血管分布。Li等[26]通過加入鋰(Li)制作了多孔凝膠/納米鋰-羥基磷灰石/明膠微粒/(Li-nHA/GMs/rhEPO)支架，該支架具有良好的機械抗壓強度，能夠連續控制Li和重組促人紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)的釋放，改善糖皮質激素治療后BMSCs和血管內皮細胞的存活率，增加成骨細胞和血管生成因子的表達，通過激活Wnt信號通路從而上調HIF-1α/VEGF的表達。已知的一些金屬離子及化合物可以通過增強并上調HIF-1α的表達，對其下游基因進行調控從而促進骨修復；其他未知的是否也具有類似的功能還有待進一步研究證實。

2.2 基因改造 在骨骼發育的過程中，通過細胞非自治機制激活骨骼模型，可協調骨形成的時間、方向和程度。Chen等[27]將SOX-9基因(sry related high-mobility group box gene-9，SOX-9)轉染入三維漸進多孔聚乳酸-聚乙醇酸共聚物PLGA，形成PLGA/Sox-9復合支架，該支架協同上調HIF-1α表達，刺激了ADSCs的軟骨分化，從而使得ADSCs獲得了與軟骨細胞相關的生物學特性。Wang[28]和Wan等[29]研究表明，選擇性刪除pVHL基因實現了老鼠體內HIF-1α高表達進而促進了VEGF高表達，明顯促進了高密度、血管化長骨的形成。Zou等[30]采用基因點突變法將基因Lenti-CA5、Lenti-WT(野生型，HIF-1α)和Lenti-LacZ轉染植入大鼠BMSCs中，構造了一種有效的HIF-1α(CA5)的活性形式，并與鈣鎂磷酸水泥支架結合在一起，以修復大鼠的顱蓋骨缺陷。結果表明，HIF-1α的過表達顯著促進了成骨標志相關mRNA和蛋白的表達，并發現具有局部高密度的強健新骨形成。最近的實驗研究證實，對HIF-1α通過相關的基因或靶點進行基因的敲低或過表達是一種有效的激活HIF-1α手段，但機制有待進一步探討。

2.3 材料功能性改造 支架自身強度可以保持較高的孔隙度進而對低氧缺氧作出反應，并激活許多支持血管生成的基因[10]。有序的介孔通道結構和高比表面能夠有效地傳輸抗生素藥物進而提高抗生素的生物利用率[11，28]。材料不同的MBG支架可以通過化學鍵作用實現對HIF-PH抑制劑的持續釋放來降低細胞毒性、延長其半衰期，激活HIF-1α并誘發后續的血管生成。同時，3D打印技術通過對生物材料的分層精確堆積可以控制外形、調節內部孔隙結構、大小、分布達到有利于骨形成的效果和解決移植的孔隙率和血管化問題。Zhang等[31]通過3D打印和旋轉涂層成功制備的介孔MBG修飾-β-磷酸三鈣(MBG-β-TCP)支架，具有分層孔隙結構和功能支撐表面，明顯增強MBG-β-TCP支架的抗壓強度和礦化能力。試驗結果表明，該復合支架可提升兔BMSCs的成骨相關基因表達和蛋白分泌；同時也可以提高了HUVECs的附著和血管生成相關基因表達。總之，材料功能性改造可以激活HIF-1α和其他相關基因的表達，進而促進骨修復。

2.4 中醫藥 最近研究發現，中醫藥可以激活HIF-1α從而影響缺血性相關疾病的發生、發展。紅景天[32]激活HIF-1α進而誘導EPO表達來調節機體對缺氧的反應；木通皂苷[33]上調HIF-1α/VEGF通路促進血管生成和傷口愈合；梓醇和葛根素[34]上調細胞外蛋白調節激酶/磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白/HIF-1α信號通路來達到減少梗死體積、保護血管完整性和抑制內皮細胞凋亡的效果；芪參益氣滴丸[35]能夠下調miR-223-3p從而抑制核糖體S6蛋白激酶抗體/HIF-1α信號通路來促進缺血心肌血管生成的能力。隨著研究的進一步深入，HIF-1α的作用也不斷被闡釋。Wu等[36]在探討再生障礙性貧血患者的骨髓間血管生成的差異時，發現“陰虛證”患者與“陽虛證”患者相比，VEGF和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)表達降低，而HIF-1α表達升高。Yuan等[37]在研究補腎通絡湯對血管生成和骨吸收的影響時，發現補腎通絡湯顯著降低了在股骨干骺端降鈣素受體和組織蛋白酶K的mRNA和蛋白水平，并抑制了卵巢切除大鼠的骨吸收。在動物模型中，補腎通絡湯降低了骨質疏松癥的破骨細胞活化和骨吸收主要與激活HIF-1α增加VEGF表達進而促進血管生成功能和抑制NF-κB配體(RANKL/OPG)信號通路有關。中醫藥在促進骨修復自古有之，近代研究發現激活HIF-1α通路是中醫藥促進骨修復有利證據，但這只是作用機制中的冰山一角，更多的作用途徑有待挖掘。

3 結論與展望

組織工程骨可以通過激活HIF-1α改善其血液灌注不足進而促進骨代謝/修復。HIF-HP抑制劑、基因改造、材料粒徑、結構改變、功能性表面修飾和中醫藥的使用等均可激活HIF-1α，從而促進一系列血管生長因子的表達，通過改善血管舒張、血管滲透性、內皮細胞出芽、增殖、遷移等方式促進骨再生。HIF-PH抑制劑激活HIF-1α通路目前研究最為普遍，但存在著作用機制不全面、系統性不強和臨床證據不足的缺陷；同時基因改造技術作為前沿技術有待進一步研究和臨床驗證。

復合骨支架通過激活HIF-1α促進骨修復只是骨組織工程的一種途徑，但其過程卻涵蓋了骨修復和成血管化的多個方面，其作用十分關鍵。根據骨損傷的具體情況和患者的經濟情況選擇合適的生物支架，骨損傷有望做到個性化的治療，因人制宜。傳統中醫藥具有精準醫學和個性化治療的顯著特點，目前研究從一定程度上揭示了其可以激活HIF-1α促進骨代謝，但中醫藥治療存在臨床應用實例不足等問題、以及在對激活HIF-HP抑制劑從而誘導HIF-1α的表達的作用機制方面仍不明確，這可以作為未來研究的重要切入點。