醋酸尼潑松對皮狀絲孢酵母產(chǎn)微生物油脂的影響

汪 洲 許鵬飛 肖玲玲 王 棟 龔大春

(1. 三峽大學 生物催化重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2. 湖北三峽職業(yè)技術(shù)學院，湖北 宜昌 443002；3. 車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室，河南 南陽 473000)

面對化石燃料的日益枯竭，環(huán)境的不斷惡化，尋求新的可再生的清潔能源成為一種必然趨勢．生物柴油是一種可以直接代替化石燃料，用于柴油發(fā)動機燃燒的清潔、可再生能源[1]．在我國近十年來得到較大范圍的推廣．但由于其原料主要來源于地溝油、植物油下腳料等，致使生物柴油的生產(chǎn)原料來源不穩(wěn)定、成份復雜、價格波動大，極大限制了生物柴油的正常生產(chǎn)供應．因此開發(fā)穩(wěn)定、清潔、可再生的生物柴油原料成了近年來的研究熱點．

微生物油脂是一種利用微生物，比如酵母菌、藻類、霉菌等在一定生長條件下將碳氫化合物、碳水化合物等在體內(nèi)生產(chǎn)積累產(chǎn)生的油脂[2-3]，其油脂主要成分為甘油三酯(TAG)，在組成上與植物油如棕櫚油、菜籽油相似，以C16和C18油脂為主，可規(guī)?；a(chǎn)，環(huán)保．有研究表明酵母油脂可以用于生物柴油的制備[4]，具有較好的產(chǎn)業(yè)化前景．但一般酵母油脂含量在25%左右，其菌種選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化至關(guān)重要[5-6]．糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體激素，具有調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的生物合成和代謝的作用，因此本文擬研究糖皮質(zhì)激素藥物醋酸潑尼松對皮狀絲孢酵母的生長影響，以及對生物油脂積累的貢獻，旨在提高皮狀絲孢酵母合成生物油脂的能力．國內(nèi)尚無相關(guān)文獻報道．

1 材料與方法

1.1 菌種

皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)由三峽大學艾倫·麥克德爾米德再生能源研究所提供．

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(%)：葡萄糖1，蛋白胨1，酵母浸粉0.5，瓊脂2．種子液培養(yǎng)基(%)：蔗糖2.5，酵母浸膏0.6，麥芽浸粉0.5，硫酸鎂0.05，磷酸氫二鈉0.4，磷酸二氫鉀0.1．發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：葡萄糖6，酵母浸膏0.6，麥芽浸粉0.5，硫酸鎂0.05，硫酸氫二鈉0.4，磷酸二氫鉀0.1．

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

用接種環(huán)從原始菌種中蘸取少量菌液接種到斜面上，30℃培養(yǎng)3 d．

1.3.2 皮狀絲孢酵母生長曲線測定

從活化的斜面上挑取一個菌落接種到100 mL種子液培養(yǎng)基中，在28℃，200 rpm培養(yǎng)，每隔2 h取出少量菌液，以沒有接種的種子液為空白，用波長為600 nm的分光光度計測定生物量，記錄吸光值．以培養(yǎng)時間(h)為橫坐標，以吸光值(OD600)為縱坐標繪制酵母生長曲線．

1.3.3 種子液制備

從活化的斜面上挑取一個菌落接種到100 mL種子液培養(yǎng)基中，在28℃，200 rpm培養(yǎng)至對數(shù)期和穩(wěn)定期交叉所對應時間點．

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基制備

按10%的接種量從培養(yǎng)好的種子液中吸取10 mL種子液接種到100 mL含不同濃度醋酸潑尼松的發(fā)酵培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的醋酸潑尼松mg/L(0，50，100，150，200，250，300)，以不添加醋酸潑尼松的發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對照，培養(yǎng)48 h．

1.3.5 生物量的測定

將培養(yǎng)90 h的發(fā)酵培養(yǎng)基取出，將發(fā)酵液倒入離心管中配平，8 500 rpm離心10 min，取出離心管，去除上清液，用去離子水洗滌菌體3次，將菌體倒入已稱重(M1)的濾紙上，放入80℃烘箱中烘干至恒重．取出濾紙用分析天平精確稱重(M2)，則干菌體量為M=M2-M1．

1.3.6 菌體油脂提取

將發(fā)酵培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液8 500 rpm離心10 min集菌，放入烘箱烘干，每克干菌體加入5 mL 8 mol/L的鹽酸，混合均勻后室溫靜置1 h，然后沸水浴處理10 min，迅速冷卻，恢復到常溫后加入2倍體積的氯仿-甲醇(V∶V=2∶1)溶液，混合均勻后室溫靜置30 min，4 500 rpm離心10 min．萃取得氯仿層，上層溶液再加10mL氯仿，振蕩均勻，離心，進行二次萃取得氯仿層，合并氯仿．旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿得油脂，稱重[7-8]．

酵母細胞油脂含量=油脂質(zhì)量/干菌體量×100%

油脂產(chǎn)量(g/L)=酵母細胞量(干重)×油脂含量/總裝樣(L)×100%

1.3.7 油脂成分分析

油脂甲酯化：取1mL油脂放入15 mL離心管中，加入石油醚-乙醚(3∶1)3 mL，浸潤提取15 min后，再加入0.4 mol/L的KOH-CH3OH溶液1 mL，震蕩搖勻后放于50℃水浴15 min左右即可，取出后沿管壁加入5% NaCl溶液使有機層上升[9-10]，靜置分層后，用注射器取其上層清液，經(jīng)過濾后加入到1.5 mL的氣相色譜樣品瓶內(nèi)，進行氣相分析．

氣相色譜檢測：色譜柱為毛細管柱(DB-FFAP)，進樣口溫度280℃，分流比為30∶1，流量為1.0 mL/min，柱溫60℃保持1min，25℃/min升溫到200℃不保持，3℃/min升溫到230℃保持20 min．檢測器溫度為280℃，H2流量40 mL/min、空氣流量450 mL/min、尾吹流量30 mL/min．對亞油酸和油酸采用外標法進行定量測定．

2 結(jié)果與討論

2.1 皮狀絲孢酵母接種時間選取

從圖1可以看出皮狀絲孢酵母的生長分為以下幾個時期：0～10 h是為菌體遲緩期；10～20 h為菌體對數(shù)生長期；20～50為菌體生長穩(wěn)定期．因此選取培養(yǎng)18～20 h的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，此時菌齡的酵母活力最高．

圖1 皮狀絲孢酵母生長曲線

2.2 醋酸潑尼松對皮狀絲孢酵母生長的影響

從圖2可以看出，醋酸潑尼松添加對皮狀絲孢酵母的生長有顯著的影響．當醋酸潑尼松添加到100 mg/L的時候，皮狀絲孢酵母菌體量從最初的9.7 g/L增加到最大值16.3 g/L，增長了68%．可見醋酸潑尼松對皮狀絲孢酵母菌體的生長有著極大的促進作用，能使菌體大量生長繁殖，對單細胞中生物油脂含量影響有待進一步確證．

圖2 醋酸潑尼松的不同用量對皮狀絲孢酵母生長的影響

2.3 醋酸潑尼松對皮狀絲孢酵母油脂積累的影響

從圖3、圖4可以看出，添加醋酸潑尼松溶液后，油脂含量和油脂產(chǎn)率均有較大變化．在醋酸潑尼松低質(zhì)量濃度區(qū)域(100 mg/L以下)時，由于菌體量增加較快，生物油脂在細胞中含量只是緩慢增加，大部分營養(yǎng)用于細胞合成，此時醋酸潑尼松對酵母細胞脂肪積累促進作用不大；但當醋酸潑尼松質(zhì)量濃度達到200 mg/L時，醋酸潑尼松對酵母細胞脂肪積累促進作用明顯增強，含量可以提高40%；此時菌體濃度也較高，油脂產(chǎn)量從2.5 g/L增加到4.8 g/L，油脂產(chǎn)量提高了92%．

圖3 醋酸潑尼松的不同用量對皮狀絲孢酵母生物油脂積累的影響

圖4 醋酸潑尼松的不同用量對皮狀絲孢酵母生物油脂產(chǎn)量的影響

根據(jù)油脂含量和油脂產(chǎn)量綜合分析可知，低濃度區(qū)域的醋酸潑尼松有助于菌體的生長，但對單個酵母中的油脂積累影響不明顯，較高濃度的醋酸潑尼松更加有利于油脂的積累．當醋酸潑尼松質(zhì)量濃度增加到250 mg/L時，油脂增加量略有下降，可能與醋酸潑尼松毒性增加有關(guān)．研究表明，醋酸潑尼松添加量對皮狀絲孢酵母菌體量增加和對油脂含量影響并不同步，為了保證前期菌體生長和后期油脂積累，可以從工藝上選擇分步添加方法，實現(xiàn)皮狀絲孢酵母生物油脂產(chǎn)量的最大化．

2.4 分批添加醋酸潑尼松用量對皮狀絲孢酵母生物油脂產(chǎn)量的影響

采用在皮狀絲孢酵母快速增值期間，發(fā)酵30 h前添加量控制醋酸潑尼松用量在100 mg/L，然后在發(fā)酵第30 h的時候，補加醋酸潑尼松用量到200 mg/L，進行試驗．通過測定油脂結(jié)果表明：分批添加添加醋酸潑尼松用量皮狀絲孢酵母，前期保證酵母生長，后期保證皮狀絲孢酵母油脂積累達到最大是可行的．通過50 h培養(yǎng)，可以達到皮狀絲孢酵母油脂產(chǎn)量5.7 g/L，比一次添加醋酸潑尼松所產(chǎn)微生物油脂再提高19%．

圖5 分批添加醋酸潑尼松對皮狀絲孢酵母生物油脂產(chǎn)量的影響

2.5 皮狀絲孢酵母油脂脂肪酸組成

從圖6、7可以看出，皮狀絲孢酵母中生物油脂成分添加醋酸潑尼松前后油脂主要成分相同，說明醋酸潑尼松未改變油脂的合成途徑，但與和菜籽油等植物油成分相似，均含有十六烷酸、硬脂酸、油酸、亞油酸，但沒有亞麻油、花生酸甘油酯；與此同時，雖然添加醋酸潑尼松后對皮狀絲孢酵母中生物油脂種類沒有影響，但對油脂脂肪酸中油酸、亞油酸含量有較大影響，分別增加21.6%、32.3%．皮狀絲孢酵母所產(chǎn)油脂可以用于合成生物柴油，為綠色可再生的能源-生物柴油的生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)原料，不與人爭糧．

1.十六烷酸甲酯；2.硬脂酸甲酯；3.油酸甲酯；4.亞油酸甲酯圖6 皮狀假絲酵母油脂主要成分譜圖

1.十六烷酸甲酯；2.硬脂酸甲酯；3.油酸甲酯；4.亞油酸甲酯；5.亞麻酸甲酯；6.花生酸甲酯；7.花生-烯酸甲酯圖7 菜籽油脂肪酸甲酯氣相譜圖

3 結(jié) 論

研究表明，醋酸潑尼松對皮狀絲孢酵母的生長和油脂積累都有顯著的促進作用，與添加量和時間密切相關(guān)．添加醋酸潑尼松100 mg/L，可以有效促進菌體的生長，使皮狀絲孢酵母生物量達到最大，比未添加醋酸潑尼松提高68%；一次添加醋酸潑尼松200 mg/L，對皮狀絲孢酵母油脂積累油脂最為明顯，可以提高98%的產(chǎn)量．如果采用分批添加醋酸潑尼松至200mg/L，即30 h前使添加醋酸潑尼松維持100 mg/L，30 h后補加醋酸潑尼松，維持在200 mg/L，微生物油脂產(chǎn)量可以從最初2.5 g/L提高到5.7 g/L，共提高128%，通過氣相檢測發(fā)現(xiàn)酵母油脂脂肪酸的組成含量也發(fā)生了變化，油酸、亞油酸含量分別增加21.6%、32.3%．本文對提高皮狀絲孢酵母生物量和油脂積累提供了一種新的方法．本課題組還通過添加甾體激素類醋酸地塞米松、氫化可的松、氟米松等實驗對皮狀絲孢酵母生長和油脂積累情況進行了考察，實驗表明均有一定程度促進作用，后期對甾體激素促進皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的內(nèi)在機理和工藝需要進一步優(yōu)化．

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