色譜法分析重組單克隆抗體電荷異質(zhì)性應(yīng)用進展

任華景，劉曉志，杜 力，高 健，王志明

0 引言

單克隆抗體由2條重鏈2條輕鏈組成，相對分子質(zhì)量高達150 kDa左右，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。目前，單克隆抗體大多是采用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)進行生產(chǎn)，單克隆抗體在生物化學(xué)和生物物理方面是異質(zhì)的，這主要取決于復(fù)雜的翻譯后修飾和降解事件[1]，導(dǎo)致了產(chǎn)品的分子大小、電荷、糖基化修飾等不均一性及其相應(yīng)的變體產(chǎn)生[2]。采用一些電荷分離技術(shù)如等電聚焦(IEF)凝膠電泳、毛細管等電聚焦(cIEF)凝膠電泳、陽離子交換色譜(CEX)、陰離子交換色譜(AEX)分析單抗會發(fā)現(xiàn)變體，這些變體被稱為酸性或堿性物質(zhì)。IEF方法分析單抗，低于等電點(PI)的為酸性變體，高于PI的為堿性變體。基于色譜法分析，酸性和堿性物質(zhì)界定是通過主峰的保留時間。CEX方法檢測酸性物質(zhì)變體峰比主要物質(zhì)峰先洗脫出來，堿性變體峰比主要物質(zhì)峰晚洗脫出來；AEX方法檢測酸性物質(zhì)變體峰比主要物質(zhì)峰晚洗脫出來，堿性變體峰比主要物質(zhì)峰早洗脫出來。

盡管有學(xué)者同意采用等點聚焦電泳和層析圖譜方法來計算酸性和堿性物質(zhì)的量，但由于分離機制的不同，計算這些物質(zhì)的量仍存在區(qū)別。IEF分離抗體變體是基于總電荷的不同(表觀PI)，但是，除總電荷外，在通過色譜法分離抗體變量時發(fā)現(xiàn)電荷分布也起著關(guān)鍵作用，這可能影響抗體和介質(zhì)的相互作用。IEF和離子交換(IEX)的不同已有報道[3]。如：鼠抗片段通過弱陽離子交換柱分離出峰的保留時間不同，但是采用IEF分析顯示了相同的PI[3]。人鼠嵌合體單抗的Fab片段無論是在輕鏈上還是在重鏈上都有焦谷氨酸，所以沒有發(fā)現(xiàn)不同的PI，可以通過強陽離子交換(SCX)來分析。這些例子說明基于色譜法分離不僅僅依賴于所有的電荷分布，在不存在電荷分布不同的情況下，一樣可以達到分離的效果。不過主要的分離動力還是來自于電荷分布的不同。

在重組單克隆抗體的生產(chǎn)、儲存、運輸?shù)冗^程中，往往會發(fā)生產(chǎn)品的聚集、降解及各種翻譯后修飾，從而導(dǎo)致產(chǎn)品的分子大小、電荷、糖基化修飾等不均一性及其相應(yīng)的變體產(chǎn)生[4]。電荷變體主要影響抗體體內(nèi)和體外性狀。已經(jīng)被證實抗體使用化學(xué)修飾能改變結(jié)合蛋白或細胞膜靶標，從而影響組織穿透、組織分布和藥代動力學(xué)(PK)[5]。變體的作用高度依賴于性質(zhì)，翻譯后修飾的位置和程度，而最終這些變體形成了酸性和堿性物質(zhì)。

本綜述主要基于色譜技術(shù)收集變體來分析描述酸性和堿性物質(zhì)[6]，酸性和堿性物質(zhì)通常由IEF和cIEF觀察到，從IEF和cIEF收集足夠的材料用于詳細描述是具有挑戰(zhàn)性的。

1 單克隆抗體的主要物質(zhì)

抗體中的主要物質(zhì)在色譜中主峰的位置洗脫。主要物質(zhì)不一定對應(yīng)于未修飾或者未降解的抗體。主峰通常是由具有3種典型的翻譯后修飾的抗體種類組成：①N-末端谷氨酰胺(Gln)環(huán)化為pyroGlu；②去除重鏈C-末端賴氨酸(Lys)；③帶有中性寡糖的CH2結(jié)構(gòu)域中保守的天冬酰胺(Asn)殘基的糖基化。主要物質(zhì)將作為對酸性和堿性物質(zhì)詳細表征的重要控制。

1.1 N-末端Gln環(huán)化作用 N-末端Gln在輕鏈和重鏈之一或兩者的基因中編碼，其可以在合成后自發(fā)地環(huán)化形成pyroGlu。色譜法分析時發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗體含有N-末端pyroGlu而不是原始Gln，因此作為主峰洗脫[7-8]。

1.2 C-末端賴氨酸去除 同樣，重鏈C-末端的Lys在重鏈基因中編碼。羧肽酶處理后導(dǎo)致的不完全去除的C-末端使得抗體攜帶0、1或2個C-末端賴氨酸殘基[9]。通常在主要物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)沒有任何C-末端賴氨酸的抗體[10]。

1.3 N-連接的寡糖糖基化 在CH2結(jié)構(gòu)域中保守的Asn殘基用N-連接的寡糖糖基化，從哺乳動物細胞中獲得的重組單抗主要糖型是核心巖藻糖苷復(fù)合物雙天線結(jié)構(gòu)，帶有0、1、2個末端半乳糖殘基。

2 單克隆抗體的酸性物質(zhì)

酸性物質(zhì)是抗體的變體，用CEX-HPLC法分析發(fā)現(xiàn)其比主峰早洗脫出來，用AEX法則比主峰晚洗脫出來。形成酸性物種的主要原因如下。

2.1 唾液酸 唾液酸一般是構(gòu)成了酸性物質(zhì)。在NS0細胞中表達的重組IgG1抗體中的酸性級分中檢測到唾液酸[8]。在CHO細胞表達的重組IgG1抗體中的酸性級分中也檢測到了高水平的唾液酸[11]。唾液酸酶處理后，用CEX-HPLC分析山羊表達的重組單克隆抗體時，發(fā)現(xiàn)酸性物質(zhì)的百分比更低，表明唾液酸的存在是這些酸性物種的主要原因[10]。采用CEX分析時，在IgG4抗體的酸性區(qū)域中也檢測到了唾液酸[12]。

2.2 天冬酰胺殘基的脫酰胺化 天冬酰胺殘基的脫酰胺化可能為酸性物質(zhì)產(chǎn)生的主要原因。脫氨發(fā)生在可變結(jié)構(gòu)域，特別是在暴露的和靈活的互補決定區(qū)(CDR)中以及在恒定結(jié)構(gòu)域中。CDR區(qū)殘基的脫酰胺化幾乎保證了酸性物質(zhì)的產(chǎn)生[13]。Asn殘基的脫酰胺在CH3的不變區(qū)域具有氨基酸序列SNGQPENNYK已被廣泛報道。盡管來自每個位點的特定產(chǎn)物仍然有爭議，但通常認為脫酰胺化僅發(fā)生在該序列的第1和第2個Asn殘基處[14]。恒定區(qū)中Asn殘基的脫酰胺化也最可能導(dǎo)致酸性物質(zhì)的形成[15]。

2.3 其他修飾 其他修飾也可能導(dǎo)致酸性物質(zhì)的產(chǎn)生。如：通過CEX分析時，具有非經(jīng)典二硫鍵的IgG2(IgG2B和IgG2A /B)比具有經(jīng)典鍵聯(lián)(IgG2A)的分子早洗脫[16]。使用AEX分析時，首先，在重組人IgG2中鑒定的含有三硫鍵的抗體比主峰洗脫晚，因此認為對應(yīng)的是酸性物質(zhì)[17]。研究顯示，具有高甘露醇含量的抗體變體在重組單抗的酸性部分中富集，但是在高甘露糖寡糖和具有核心巖藻糖的復(fù)合雙觸角寡糖之間沒有電荷差異，這也證明了色譜法分離不僅基于電荷差異，而且還基于微妙的構(gòu)象差異[18]。已經(jīng)用于制劑以防止由曝光引起氧化的硫代硫酸鹽可以與抗體反應(yīng)以形成酸性物質(zhì)[19]。糖基化、還原糖和Lys殘基的側(cè)鏈或N-末端伯胺之間的反應(yīng)由于中和了正電荷，導(dǎo)致酸性物質(zhì)的產(chǎn)生[20]。

3 酸性物質(zhì)對結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的影響

由于導(dǎo)致產(chǎn)生酸性物質(zhì)的各種修飾對結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的潛在影響高度依賴于其位置。由于柔性鉸鏈區(qū)，位于Fc區(qū)中的修飾可能對Fab片段沒有顯著影響。如：唾液酸的存在不影響抗體效力[7]，但是對抗原結(jié)合和效力具有實質(zhì)性影響。CDR區(qū)中的脫氨基化導(dǎo)致抗原結(jié)合親和力和重組單克隆抗體的效力降低[6]。糖基化增加聚集體的形成而不改變抗體構(gòu)象[21]，表明由Lys的糖基化引起的表面正電荷降低可能導(dǎo)致抗體分子之間的較低排斥。另外，具有半胱氨酰化反應(yīng)的抗體顯示出降低的熱穩(wěn)定性，更容易形成聚集體。

4 單克隆抗體的堿性物質(zhì)

堿性物質(zhì)在CEX-HPLC分析中比主要物質(zhì)峰晚洗脫出來，而在AEX-HPLC分析中早于主要物質(zhì)峰洗脫出來的物質(zhì)。形成堿性物質(zhì)的一個主要原因歸納如下。

4.1 C末端Lys不完全去除 形成堿性物質(zhì)的一個主要原因是不完全去除C末端Lys。具有重鏈C末端Lys的單抗，由于額外的正電荷，而比主要物質(zhì)更偏堿性[22]。由于羧肽酶B(CPB)能夠特異性地去除C-末端堿性氨基酸殘基，因此比較CPB消化前后抗體的色譜圖，可以清楚地證明C末端Lys對堿性物質(zhì)形成的貢獻。

4.2 N末端Gln與輕鏈或重鏈或兩者的pyroGlu的不完全環(huán)化 堿性物質(zhì)形成的另一種常見的修飾是N末端Gln與輕鏈或重鏈或兩者pyroGlu的不完全環(huán)化。Gln最初編碼在基因中，但其可以經(jīng)歷自發(fā)反應(yīng)以產(chǎn)生pyroGlu。具有原始Gln抗體的表觀pI高于主要物質(zhì)，因此被稱為堿性物質(zhì)[23]。

4.3 脫酰胺化 與脫酰胺相似，異構(gòu)化頻繁發(fā)生在CDR區(qū)域，很少在恒定區(qū)域發(fā)生[24]。經(jīng)CEX分析后，重鏈CDR3中的帶有isoAsp 102的重鏈單克隆抗體比帶有原始Asp的抗體晚洗脫出來[25]。作為Asn脫酰胺和Asp異構(gòu)化的常見中間體的琥珀酰亞胺也可以有助于產(chǎn)生堿性物質(zhì)[18]。

4.4 其他修飾 幾種其他修飾可以產(chǎn)生堿性物種。通過CEX-HPLC分析時，抗體Fc區(qū)中兩個保守的甲硫氨酸(Met)殘基的氧化在堿性區(qū)域得到洗脫[26]。在重組單抗的CDR2區(qū)域中的Met殘基的氧化還導(dǎo)致堿性物質(zhì)的產(chǎn)生[26]。去除重鏈C-末端Lys后脯氨酸殘基的酰胺化導(dǎo)致堿性物質(zhì)的形成[27]。在輕鏈或重鏈的Fc區(qū)，具有從絲氨酸到精氨酸的單個氨基酸突變的重組單抗作為堿性物質(zhì)從CEX柱洗脫[28]。具有一個糖基化重鏈和一個具有短寡糖的重鏈的抗體也作為堿性物質(zhì)從CEX柱洗脫[29]。

5 堿性物質(zhì)對結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的影響

抗體的N-末端或C-末端的修飾對抗體結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能具有實質(zhì)性影響，因為這些區(qū)域是高度暴露的，并且不是任何配體結(jié)合位點的一部分。研究已證明琥珀酰亞胺形成對抗原結(jié)合親和力和效力的影響，在重鏈CDR2中含有琥珀酰亞胺的Fab片段結(jié)合親和力降低，與具有原始Asn的抗體相比，具有琥珀酰亞胺的抗體顯示出的效力有所降低[26]。

Fc區(qū)域中甲硫氨酸殘基的氧化不影響重組單抗的抗原結(jié)合與效力；然而，其確實引起主要在CH2結(jié)構(gòu)域中的構(gòu)象變化，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性降低和聚集傾向增加[30]。熱穩(wěn)定性降低通過差示掃描量熱法(DSC)測量重鏈CDR2區(qū)域Met殘留的氧化得到證實[31]。

6 結(jié)論

制備出重組單抗樣品時，通常能觀察到酸性和堿性物質(zhì)。完全消除酸性和堿性物質(zhì)是不現(xiàn)實的和不必要的。對于與特異性宿主表達系統(tǒng)相關(guān)的重組單抗，一些蛋白修飾是特有的(如：通過山羊乳中的馬來酸修飾)，還有一些蛋白修飾是在蛋白生產(chǎn)和配制過程中發(fā)生的(如：硫代硫酸鹽修飾)。其對生物功能的影響高度依賴于位點和修飾水平。對于局限于Fc區(qū)的修飾，即使存在較高水平也不會對結(jié)合親和力有直接影響。類似地，局限于Fab區(qū)的修飾可能不影響Fc相關(guān)功能，如：受體結(jié)合。修改的水平對于效果有很大的影響。如：Asn55的脫酰胺度較低在重鏈CDR區(qū)域不影響一種抗體的效力[7]，但是一條重鏈中的isoAsp55或Asp55可將另一種抗體的效力降低[26]。脫酰胺對2種抗體影響的區(qū)別可能是由于與其相互作用的抗原不同，此外，脫酰胺占百分比也起了重要作用。通過色譜法分析已鑒定出導(dǎo)致酸性和堿性電荷變體的修飾，但解酸性和堿性變體的性質(zhì)仍不明確。因此，在單克隆抗體研發(fā)和制備的過程中，必須要評估酸性或堿性變體對主要物質(zhì)的穩(wěn)定性和功能的影響。修飾可能是關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)或關(guān)鍵過程屬性(KPA)。因此，為了確保治療性重組單克隆抗體的有效性和安全性，分析酸性和堿性物質(zhì)的產(chǎn)生至關(guān)重要。

參考文獻：

[1] 于傳飛,王文波,劉春雨,等.離子交換色譜對抗 VEGFR2單抗的電荷異質(zhì)性分析[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進展,2014,42(5):17-21.

[2] Liu H,Gaza-Bulseco G,Faldu D,et al.Heterogeneity of monoclonal antibodies[J].J Pharm Sci,2008,97(7):2426-2447.

[3] Moorhouse KG,Nashabeh W,Deveney J,et al.Validation of an HPLC method for the analysis of the charge heterogeneity of the recombinant monoclonal antibody IDEC-C2B8 after papain digestion[J].J Pharm Biomed Anal,1997,16(4):593-603.

[4] 張坤明.人用重組單克隆抗體電荷異質(zhì)性的研究進展[J].中國生物制品學(xué)雜志,2016,29(2):206-212.

[5] Pardridge WM,Kang YS,Diagne A,et al.Cationized hyperimmune immunoglobulins:pharmacokinetics,toxicity evaluation and treatment of human immunodeficiency virus-infected human-peripheral blood lymphocytes-severe combined immune deficiency mice[J].J Pharmacol Exp Ther,1996,276(1):246-252.

[6] Vlasak J,Ionescu R.Heterogeneity of monoclonal antibodies revealed by charge-sensitive methods[J].Curr Pharm Biotechnol,2008,9(6):468-481.

[7] Lyubarskaya Y,Houde D,Woodard J,et al.Analysis of recombinant monoclonal antibody isoforms by electrospray ionization mass spectrometry as a strategy for streamlining characterization of recombinant monoclonal antibody charge heterogeneity[J].Anal Biochem,2006,348(1):24-39.

[8] Beck A,Bussat MC,Zorn N,et al.Characterization by liquid chromatography combined with mass spectrometry of monoclonal anti-IGF-1 receptor antibodies produced in CHO and NS0 cells[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2005,819(2):203-218.

[9] Harris RJ.Processing of C-terminal lysine and arginine residues of proteins isolated from mammalian cell culture[J].J Chromatogr A,1995,705(1):129-134.

[10]Santora LC,Krull IS,Grant K.Characterization of recombinant human monoclonal tissue necrosis factor-alpha antibody using cation-exchange HPLC and capillary isoelectric focusing[J].Anal Biochem,1999,275(1):98-108.

[11]Khawli LA,Goswami S,Hutchinson R,et al.Charge variants in IgG1:Isolation,characterization,in vitro binding properties and pharmacokinetics in rats[J].MAbs,2010,2(6):613-624.

[12]Alvarez M,Tremintin G,Wang J,et al.On-line characterization of monoclonal antibody variants by liquid chromatography-mass spectrometry operating in a two-dimensional format[J].Anal Biochem,2011,419(1):17-25.

[13]Huang L,Lu J,Wroblewski VJ,et al.In vivo deamidation characterization of monoclonal antibody by LC/MS/MS[J].Anal Chem,2005,77(5):1432-1439.

[14]Chelius D,Rehder DS,Bondarenko PV.Identification and characterization of deamidation sites in the conserved regions of human immunoglobulin gamma antibodies[J].Anal Chem,2005,77(18):6004-6011.

[15]Gandhi S,Ren D,Xiao G,et al.Elucidation of degradants in acidic peak of cation exchange chromatography in an IgG1 monoclonal antibody formed on long-term storage in a liquid formulation[J].Pharm Res,2012,29(1):209-224.

[16]Wypych J,Li M,Guo A,et al.Human IgG2 antibodies display disulfidemediated structural isoforms[J].J Biol Chem,2008,283:16194-16205.

[17]Pristatsky P,Cohen SL,Krantz D,et al.Evidence for trisulfide bonds in a recombinant variant of a human IgG2 monoclonal antibody[J].Anal Chem,2009,81(15):6148-6155.

[18]Yan B,Steen S,Hambly D,et al.Succinimide formation at Asn 55 in the complementarity determining region of a recombinant monoclonal antibody IgG1 heavy chain[J].J Pharm Sci,2009,98(10):3509-3521.

[19]Lam XM,Yang JY,Cleland JL.Antioxidants for prevention of methionine oxidation in recombinant monoclonal antibody HER2[J].J Pharm Sci,1997,86(11):1250-1255.

[20]Quan C,Alcala E,Petkovska I,et al.A study in glycation of a therapeutic recombinant humanized monoclonal antibody:where it is,how it got there,and how it affects charge-based behavior[J].Anal Biochem,2008,373(2):179-191.

[21]Banks DD,Hambly DM,Scavezze JL,et al.The effect of sucrose hydrolysis on the stability of protein therapeutics during accelerated formulation studies[J].J Pharm Sci,2009,98(12):4501-4510.

[22]Lau H,Pace D,Yan B,et al.Investigation of degradation processes in IgG1 monoclonal antibodies by limited proteolysis coupled with weak cation-exchange HPLC[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2010,878(11-12):868-876.

[23]Ouellette D,Alessandri L,Chin A,et al.Studies in serum support rapid formation of disulfide bond between unpaired cysteine residues in the VH domain of an immunoglobulin G1 molecule[J].Anal Biochem,2010,397(1):37-47.

[24]Terashima I,Koga A,Nagai H.Identification of deamidation and isomerization sites on pharmaceutical recombinant antibody using H(2)(18)O[J].Anal Biochem,2007,368(1):49-60.

[25]Harris RJ,Kabakoff B,Macchi FD,et al.Identification of multiple sources of charge heterogeneity in a recombinant antibody[J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl,2001,752(2):233-245.

[26]Chumsae C,Gaza-Bulseco G,Sun J,et al.Comparison of methionine oxidation in thermal stability and chemically stressed samples of a fully human monoclonal antibody[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007,850(1-2):285-294.

[27]Johnson KA,Paisley-Flango K,Tangarone BS,et al.Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain[J].Anal Biochem,2007,360(1):75-83.

[28]Ren D,Zhang J,Pritchett R,et al.Detection and identification of a serine to arginine sequence variant in a therapeutic monoclonal antibody[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2011,879(27):2877-2884.

[29]Gaza-Bulseco G,Bulseco A,Chumsae C,et al.Characterization of the glycosylation state of a recombinant monoclonal antibody using weak cation exchange chromatography and mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2008,862(1-2):155-160.

[30]Liu D,Ren D,Huang H,et al.Structure and stability changes of human IgG1 Fc as a consequence of methionine oxidation[J].Biochemistry,2008,47(18):5088-5100.

[31]Teshima G,Li MX,Danishmand R,et al.Separation of oxidized variants of a monoclonal antibody by anion-exchange[J].J Chromatogr A,2011,1218(15):2091-2097.