一種快速批量轉Bt基因抗蟲棉雜交后代的篩選方法

趙俊俠 ，陳 耕 ，潘轉霞 ，郭海莉 ，夏 芝 ，孫振綱 ，朱永紅 ，胡曉麗

（1.山西省農業科學院棉花研究所，山西運城044000；2.稷山縣農業局，山西稷山043200）

轉基因抗蟲棉是指棉花細胞染色體上整合有外源抗蟲基因的棉花品種。抗蟲基因通常為來源于蘇云金芽孢桿菌的Bt基因（Bacillus thuringiensis，蘇云金芽孢桿菌）的簡稱，它是一種革蘭氏陽性菌，在地球上分布十分廣泛。Bt基因對鱗翅目昆蟲有專一的殺傷作用，能產生多種對昆蟲有特異活性的殺蟲蛋白。棉花抗蟲育種歷史不長，由于外源基因轉化技術的局限，目前所獲得的轉基因抗蟲棉，其遺傳基礎還較為單一，遠不能滿足現代棉花生產發展對品種的高要求。在棉花品種選育中，通過不同性狀的棉花株系進行雜交，以期獲得具有不同親本所攜帶的優良性狀，并且一定要兼具抗蟲特性，即后代材料要攜帶Bt基因。在轉基因抗蟲棉雜交后代材料中，由于雜交二代出現分離，后代材料含有大量無效或不可利用的雜交后代。所以，在大量的后代材料中，選擇含有外源基因的目標植株是培育轉基因抗蟲棉的重要步驟。根據NptⅡ基因（卡那霉素標記基因）與Bt抗蟲基因緊密連鎖的關系[1]，通過對植株抗卡那霉素特性的篩選，來獲得帶有Bt基因的后代材料。

轉基因抗蟲棉雜交后代鑒別的常用方法有PCR擴增電泳檢測法和田間卡那霉素涂抹鑒定法[2]。PCR擴增電泳是最常用的實驗室轉基因植株遺傳檢測方法[3]，但存在諸多缺點，需要實驗室和儀器，DNA制備過程復雜繁瑣且實驗技術要求高，鑒別時，花費且工作量巨大。田間卡那霉素涂抹鑒定[4]，夏天高溫作業一株一葉涂抹，工作量大而繁重，受天氣環境影響大且因操作的人為差異造成鑒定結果假陽性偏多。因此，把棉花轉基因技術和種子發芽技術相結合，設計出本試驗的一套技術方法，不同于實驗室操作、高效快捷、簡便實用的棉花轉基因后代植株的檢測與篩選方法，以滿足在棉花育種生產中，大量群體轉基因抗蟲棉雜交后代的篩選與鑒定需要。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為以多抗、豐產、高衣分晉棉19為母本，抗蟲品系運148為父本雜交組合的F2種子，隨機選出100粒備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 卡那霉素選擇試驗 種子經硫酸脫絨后，用70%酒精浸泡2 s，然后放入10%～15%H2O2消毒2～4 h，用無菌水沖洗，浸泡于三角瓶中，封口，在20～30℃下經過24 h，待種子萌動后，去種皮接種或直接放入培養后續制備的器皿中培養[5]。條件許可的實驗室采取經高溫滅菌的培養皿，農戶、農場或無實驗條件時采用蒸煮過的盤碟等，在其底部鋪2層高溫滅菌或蒸煮過的紗布或毛巾一層。

將150 mg/L的卡那霉素溶液倒入培養皿或盤碟，盤碟加盤碟為蓋，保持水分，光照培養或暗培養均可，培養溫度28℃。器皿大小以需檢測種子多少為根據準備。培養時間：去種皮接種培養需要2 d[6]，直接放入培養不去種皮接種需要4 d。2 d后，對種子下胚軸伸長觀察并對長度進行測量，生長較快的種子，下胚軸伸長達2.3 cm以上，飽滿有活力，部分種子則表現為下胚軸略微伸長或僅僅子葉稍微展開，缺乏生機，下胚軸長度不到2.3 cm。

1.2.2 PCR檢測對比試驗 100粒F2出現分離的雜交后代的種子，用1.2.1所述方法進行篩選鑒別后，提取棉花幼苗葉片DNA并進行PCR擴增電泳。

2 結果與分析

本試驗選取100粒F2出現分離的雜交后代種子，測量種子萌發后的下胚軸長度，再提取棉花幼苗葉片DNA進行PCR擴增電泳，進行Bt基因檢測。由于有些種子成熟度較差，處理過程中腐爛或沒有成苗，共獲得64例有效幼苗，下胚軸伸長大約2.3 cm以上的有36株，不到2.3 cm的有28株。結果表明，使用該方法對轉基因抗蟲棉雜交后代材料篩選與經PCR檢測結果一致。因為在導入的外源基因構建中，NptⅡ基因（卡那霉素標記基因）與Bt抗蟲基因緊密連鎖，因此，含有NptⅡ基因（卡那霉素標記基因）的檢測材料會在150 mg/L的卡那霉素基質上生長伸長，伸長的種子含著Bt抗蟲基因，反之則不含抗蟲基因。

3 結論與討論

本研究討論的是以Bt抗蟲棉的成熟種質材料作為親本產生的雜交后代，在推廣生產中應用的品種，Bt基因和NptⅡ基因連鎖，存在于一條染色體上，在育種中表現為穩定遺傳。如李汝忠等[7]用抗蟲親本與非抗蟲親本直接雜交的F1，在田間自然感蟲條件下，均表現出高抗棉鈴蟲性，抗性不分離。該方法還可以用于轉基因單株[8-9]的檢測。即使出現個別分離現象，在品種育成過程中，會通過抗蟲性檢測試驗排除，因為不管是本研究的試驗方法、卡那霉素涂抹、PCR檢測等，都是一種對抗蟲基因的篩選替代，最終品種的抗蟲特性必須通過抗蟲性檢測。

在培育抗蟲棉花品種過程中，李朋波等[10]研究表明，以常規棉和轉基因抗蟲棉及其雜交、回交后代為材料，對卡那霉素抗性與測蟲鑒定結果進行比較。結果表明，二者鑒定結果一致性達96%以上。本研究表明，更好選擇和利用雜交組合后代中種質資源，配合育種的計劃周期，結合播種時間或南繁安排，將批量的雜交后代種子利用該方法篩選萌發后下胚軸長度2.3 cm以上的種子，可直接開溝播種于試驗區域或大田。本試驗方法不僅可以更準確地控制假陽性，而且對后代的鑒別大約能提早4～5個月，不但節省了檢測成本，縮短了檢測時間，使后續其他途徑的驗證更加具有針對性。因此，本研究的方法更利于在非實驗室條件下，對育種中大量棉花轉基因后代種子進行快速篩選與鑒定。