卵巢上皮性癌組織中HK-Ⅱ、PKB蛋白的表達及其意義

姚俊閣，李冰熠，岳青芬

(鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院婦科，河南 洛陽 471000)

卵巢上皮性癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，5年生存率僅為20%～30%，其病因及發(fā)病機制尚不明確，至今還缺少有效的早期診斷方法。因此，深入研究卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展的分子機制對尋找新的腫瘤標記物和治療靶點具有重要意義。異常活躍的糖酵解代謝是惡性腫瘤的顯著特征，通過阻斷糖酵解途徑來抑制癌細胞中能量的生成，從而達到治療惡性腫瘤。己糖激酶(HK)是糖酵解過程中的第一限速酶，其中HK-Ⅱ已被證實與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲密切相關[1]。蛋白激酶B(PKB)是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(P13K/PKB)信號通路中的關鍵蛋白。在P13K/PKB通路激活后，通過多種分子機制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，目前有研究[2]表明該通路參與了糖酵解酶HK的上游調控。

本研究通過免疫組織化學SP法檢測卵巢上皮性癌組織中HK-Ⅱ、PKB蛋白的表達水平，分析二者與卵巢上皮性癌臨床病理參數(shù)的關系及二者在卵巢上皮性癌組織中表達的相關性，從而明確HK-Ⅱ、PKB在卵巢上皮性癌中的作用及其意義，以期為臨床對卵巢上皮性癌的診斷及治療提供新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年7月至2017年3月鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院手術切除的標本96例，其中卵巢上皮性癌組織標本(惡性組)56例，年齡(53.4±10.7)歲。均經(jīng)病理檢查診斷為卵巢上皮性癌。按國際婦產科聯(lián)盟(FIGO)分期：Ⅰ—Ⅱ期20例，Ⅲ—Ⅳ期36例。低分化32例，高、中分化24例。淋巴結轉移35例，無淋巴結轉移21例。病理類型：漿液性囊腺癌21例，黏液性囊腺癌17例，子宮內膜樣腺癌8例。術前均未行放、化療。卵巢良性上皮性腫瘤組織標本(良性組)20例，年齡(50.4±10.6)歲。其中漿液性囊腺瘤10例，黏液性囊腺瘤10例。正常卵巢上皮組織標本(正常組)20例，年齡(49.8±9.1)歲。均為良性疾病行子宮加附件切除術的組織標本。3組年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 檢測方法

采用免疫組織化學SP法檢測各組HK-Ⅱ和PKB蛋白的表達水平。將手術標本用10%甲醛固定，并進行梯度脫水、透明、浸蠟和包埋，以厚度為4 μm 連續(xù)切片。然后，將切片脫蠟、水化、EDTA緩沖液100 ℃修復。修復后，滴加過氧化酶阻斷溶液，用動物非免疫血清(北京中杉金橋生物技術有限公司)室溫封閉。封閉后，滴加一抗HK-Ⅱ(美國Santa Cruz公司，1：100稀釋)、PKB(美國R&D公司，1：50稀釋)，陰性對照用PBS代替。生物素標記的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)進行室溫孵育。孵育后，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，PBS沖洗。沖洗后，DAB顯色。蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢。

1.3 結果判定

HK-Ⅱ蛋白表達于細胞膜和胞質，采取半定量法進行評分[3]。隨機選擇5個高倍鏡(10×40)視野進行觀察。按染色強度計分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再按照陽性細胞率計分，陽性細胞百分數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。將上述兩種得分相乘，總分<5分為陰性(—)，≥5分為陽性(+)。結果判定在雙盲下進行，每張切片分別由2名病理科醫(yī)師判讀。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；變量間的相關性分析采用Spearman相關性檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組HK-Ⅱ、PKB蛋白陽性表達率的比較

惡性組、良性組及正常組HK-Ⅱ蛋白陽性表達率分別為82.1%(46/56)、25.0%(5/20)、10.0%(2/20)。惡性組HK-Ⅱ蛋白陽性表達率顯著高于正常組、良性組(P<0.01)，良性組HK-Ⅱ蛋白陽性表達率與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。惡性組、良性組及正常組PKB蛋白陽性表達率分別為69.6%(39/56)、20.0%(4/20)、10.0%(2/20)。惡性組PKB蛋白陽性表達率顯著高于正常組、良性組(P<0.01)，良性組PKB蛋白陽性表達率與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。卵巢上皮性癌組織中HK-Ⅱ、PKB的蛋白表達均呈陽性染色，均主要位于細胞膜和細胞質中(封三圖1—2)。

2.2 HK-Ⅱ、PKB蛋白表達與卵巢上皮性癌臨床病理參數(shù)的關系

卵巢上皮性癌組織學分級為高、中分化和病理類型為漿液性囊腺癌、黏液性囊腺癌HK-Ⅱ、PKB蛋白陽性表達率與組織學分級為低分化、病理類型為子宮內膜樣腺癌比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。卵巢上皮性癌FIGO分期為Ⅰ—Ⅱ期、有淋巴結轉移HK-Ⅱ、PKB蛋白陽性表達率與FIGO分期為Ⅲ—Ⅳ期、無淋巴結轉移比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 HK-Ⅱ、PKB蛋白表達與卵巢上皮性癌臨床病理參數(shù)的關系

2.3 相關性分析

相關性分析結果顯示，卵巢上皮性癌組織中HK-Ⅱ蛋白表達與PKB蛋白表達呈正相關(r=0.402，P<0.05)。

3 討論

腫瘤細胞的代謝與正常細胞不同，即使在氧氣充足的情況下，腫瘤細胞仍主要以糖酵解途徑提供能量，這種代謝途徑的重塑被稱為Warburg效應[4]。近年來，通過阻斷糖酵解途徑來抑制癌細胞中的能量生成而達到治療惡性腫瘤的策略正備受關注。HK是細胞糖酵解途徑中的第一個限速酶，在調控糖酵解流量中起關鍵作用，而在腫瘤組織中常發(fā)現(xiàn)其同工酶類型、表達量、亞細胞分布及動力學特性等改變，其中HK-Ⅱ與腫瘤特征性代謝、細胞增殖和凋亡密切相關[5]。Hoppe Seyler等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸正常組織中HK-Ⅱ不表達或者低表達，而在宮頸癌組織中異常高表達，且與放療耐受和抵抗有關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HK-Ⅱ持續(xù)高表達與人乳頭瘤病毒癌基因E6/E7的激活有關。劉娜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌組織中HK-Ⅱ表達上調，并與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細胞的侵襲能力有關，且高表達HK-Ⅱ的患者預后較差。另有文獻[8]報道，抑制HK-Ⅱ的表達可誘導腫瘤細胞及其化療耐藥細胞通過線粒體凋亡途徑凋亡，從而提高化療療效，并在侵襲性淋巴瘤的研究中得到印證。本研究結果顯示，惡性組HK-Ⅱ蛋白陽性表達率顯著高于正常組、良性組(P<0.01)，卵巢上皮性癌FIGO分期為Ⅰ—Ⅱ期、有淋巴結轉移HK-Ⅱ蛋白陽性表達率與FIGO分期為Ⅲ—Ⅳ期、無淋巴結轉移比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，提示HK-Ⅱ不僅參與了卵巢上皮性癌發(fā)生，且與其侵襲、轉移密切相關。

P13K/AKT通路是一個經(jīng)典的抗凋亡、促增殖的信號轉導途徑，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉移及放化療抵抗中發(fā)揮重要作用。PKB是信號轉導途徑中重要的蛋白激酶，是P13K/PKB信號轉導通路的主要效應分子，其活化與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切的關系。有研究[9]表明，PKB在正常組織中低表達或不表達，而在肺癌、食管癌、乳腺癌等惡性腫瘤中過表達，并與不良預后有關。本研究結果顯示，惡性組PKB蛋白陽性表達率顯著高于正常組、良性組(P<0.01)，卵巢上皮性癌FIGO分期為Ⅰ—Ⅱ期、有淋巴結轉移PKB蛋白陽性表達率與FIGO分期為Ⅲ—Ⅳ期、無淋巴結轉移比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，其與上述研究結果一致，并提示P13K/AKT通路的激活可能是卵巢上皮性癌發(fā)生的始動因素之一，且與卵巢上皮性癌的生物學行為和預后密切相關。

有研究[10]證實，HK-Ⅱ與線粒體結合是調節(jié)細胞代謝、增殖和凋亡的關鍵。HK-Ⅱ與線粒體外膜蛋白(VDAC)結合形成線粒體結合型HK-Ⅱ，并可優(yōu)先利用線粒體產生ATP，同時解除產物G-6-P對HK-Ⅱ的抑制作用，使糖代謝能夠持續(xù)、高速地進行，為快速生長的腫瘤細胞提供足夠的能量。另外，線粒體結合型HK-Ⅱ能夠維持線粒體外膜完整性，并參與線粒體膜通透轉換孔復合物的構建，抑制促凋亡因子，阻止線粒體途徑誘導的凋亡，進而抑制腫瘤細胞的凋亡。此外，HK-Ⅱ與線粒體的結合涉及多條通路和多種因子，Gottlob等[11]報道，P13K/AKT通路參與了HK的上游調控，PKB的激活能夠促使HK-Ⅱ與線粒體VDAC相結合，進而利用ATP參與糖代謝，并通過抑制細胞色素C釋放來抑制凋亡。本研究中，相關性分析結果顯示，卵巢上皮性癌組織中HK-Ⅱ蛋白表達與PKB蛋白表達呈正相關(r=0.402，P<0.05)，提示HK-Ⅱ、PKB可能協(xié)同參與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，HK-Ⅱ、PKB蛋白的異常表達可能與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，深入研究糖酵解代謝相關限速酶及其調控機制，有望為卵巢上皮性癌的治療提供新的靶點。