蚊蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性研究進展

徐鑫 錢坤

蚊蟲由于其特殊的行為、生理結構以及與人類生活關系緊密而成為傳播人類疾病(瘧疾、絲蟲病、登革熱等)的重要媒介，是重點防治的醫學昆蟲之一。目前化學防治仍然是蚊蟲防治的主要手段，其中擬除蟲菊酯類殺蟲劑是蚊蟲防治中使用較多的化學藥劑，自20世紀廣泛使用以來，蚊蟲對其抗性水平逐步提高，抗性問題逐漸成為人們關注的重點問題。本研究主要從蚊蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性現狀、抗性風險評估和抗性機制進行綜述。

1 蚊蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性現狀

我國自20世紀70年代初開發擬除蟲菊酯類殺蟲劑以來，擬除蟲菊酯類藥劑便因其對人畜、環境友好、安全的特點被大力推廣使用，然而抗藥性問題也隨之出現。據調查，至1987年淡色庫蚊種群對溴氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯和速滅菊酯等抗性區已占27個監測點的50%以上，且其抗性發展動向超過了有機氯和有機磷類殺蟲劑［1］。近年來，在全國范圍內蚊蟲對常用擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生抗性的報道不斷。徐建敏等［2］2014年調查發現廣州市荔灣區的白紋伊蚊對氯菊酯已產生較強抗性，并且另外兩個區成蚊對擬除蟲菊酯類藥劑的抗性也在逐漸產生。此外，眾多學者在過去幾年間的采集與調查發現北京、河北、河南、江西以及山東多個城市的蚊蟲對于擬除蟲菊酯類殺蟲劑都產生了不同程度的抗性，且抗性水平正在逐步提高。另外，值得注意的是，李慶鳳［3］通過研究發現，經過氯氰菊酯處理過的淡色庫蚊的幼蟲抗性高于成蟲。多項研究證明，蚊蟲對于擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性問題已十分嚴重。

此外，有研究表明，蚊蟲也極易對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生交互抗性。調查表明，對于一種媒介蚊蟲，一旦其由于各種因素對某一種或某一類擬除蟲菊酯類藥劑產生了一定的抗性，其在很大程度上也會對同等作用機制的其余擬除蟲菊酯類藥劑產生交互抗性?？芫败幍龋?］研究發現蚊蟲對氯氰菊酯、溴氰菊酯和三氯殺蟲酯這三種常用殺蟲劑存在著交互抗性，且利用一種擬除蟲菊酯類藥劑選育的蚊蟲易對其余擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生抗性，但不同擬除蟲菊酯類殺蟲劑混合選育，蚊蟲抗性發展則有所不同。同樣地，李向東等［5］研究發現抗氯氰菊酯品系對敵敵畏以及殘殺威均可產生低度交互抗性。多項調查表明，蚊蟲一旦對一種擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生高抗性后，便會大大影響許多同等作用機制的擬除蟲菊酯類殺蟲劑的實用價值，需要合理施用該類藥劑，避免產生交互抗性。

2 蚊蟲的抗藥性風險評估

在室內進行抗性風險評估工作是目前進行抗性治理的主要手段，尤其是一種藥效較好的藥劑進入市場之前，對其進行合理的風險評估工作，可以有效預測其對于靶標害蟲抗性發展的動態情況，降低盲目用藥帶來的風險，對于制定合理、安全的抗性治理方法，具有極為重要的意義。目前，我國關于蚊蟲抗藥性風險評估報道不多，宋鋒林等［6］以淡色庫蚊的敏感與抗性品系為材料，分別使用溴氰菊酯和ES－生物丙烯菊酯兩種擬除蟲菊酯類藥劑對其進行逐代篩選，并采用現實遺傳的研究方法，計算抗性篩選后品系的現實遺傳力情況，并對這兩種藥劑的抗性風險進行室內評估，結果表明:在實驗室條件下，溴氰菊酯品系抗性發展速率顯著快于ES－生物丙烯菊酯品系，其抗藥性上升潛力也大于ES－生物丙烯菊酯品系。淡色庫蚊自然種群對ES－生物丙烯菊酯不易產生高抗藥性，但對溴氰菊酯易產生高抗藥性。劉洪霞等［7］經過17代的室內選育，發現白紋伊蚊對溴氰菊酯的抗性可達到36.7倍，白紋伊蚊對溴氰菊酯的抗性 h2為0.1257，抗性風險較大，并且根據抗性發展規律，可以預估其抗性上升十倍的代數，從而可以探究溴氰菊酯對白紋伊蚊的抗性風險，為藥劑的進一步研究奠定基礎。

3 蚊蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性機制研究

3.1 代謝抗性

3.1.1 細胞色素: P450氧化酶系(P450 s):P450 s氧化酶系是硫醇鹽蛋白的超家族，可參與多種物質的代謝解毒過程，是害蟲代謝抗性最主要的機制之一。P450 s在昆蟲中主要是對昆蟲激素(包括保幼激素與蛻皮素)的合成與分解，對殺蟲劑以及植物毒素等化合物的活化和解毒起作用。因此，細胞色素P450是許多代謝途徑中的重要解毒酶。關于細胞色素P450與昆蟲抗藥性的關系，最早發現的是P450抑制劑sesamax能夠逆轉昆蟲對西維因的抗性。體內實驗證明sesamax是P450的抑制劑，隨后體外實驗也予以證實細胞色素P450與昆蟲對藥劑西維因產生抗性有關。以往的眾多研究結果證實:與P450氧化酶系相關的抗性害蟲常常能夠表現出某種P450的過量表達。如異源表達的 CYP6A1，CYP6A2，CYP6D1等具有對殺蟲劑代謝的活性直接證明了這些P450的過量表達在殺蟲劑抗性形成中起作用。

在如今已鑒定的昆蟲 P450家族中，大多認為CYP6家族與殺蟲劑抗性的產生有著密切的關系，但是隨著研究的進行，CYP4、CYP9和CYP12家族等也漸漸進入人們的視野。曹俊等［8］研究發現兩種增效劑(PBO、TPP)對嗜人按蚊敏感品系和不同程度的抗性品系都有增效作用，故其猜測嗜人按蚊對于溴氰菊酯的抗性機理可能是解毒酶活力增強引起的，多功能氧化酶可能起著重要作用。LIU等［9］通過研究證實對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生抗性的致倦庫蚊體內CYP6AA7、CYP9J40、CYP9J34 和 CYP9M10 含量在致倦庫蚊不同生長階段都呈現顯著表達，且抗性水平越高的品系，表達水平也越高。STEVENSON等［10］研究發現抗性品系蚊蟲體內存在CYP9JS過轉錄的現象，其中以 CYP9J24、CYP9J26、CYP9J28和CYP9J32與擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性關系較為密切。KASAI等［11］利用PCR(q RT-PCR)技術檢測到埃及伊蚊體內的2個P450亞型為CYP96M6和 CYP6BB2，且其P450表達水平和氯菊酯降解速率一一對應，由此得出細胞色素P450單氧酶(P450 s)在抗性發育過程中起著重要作用，且體外代謝研究也表明P450 s與耐藥性有關聯。Toé等［12］在西非研究發現抗擬除蟲菊酯類殺蟲劑品系的蚊蟲體內的 CYP4G16、CYP6P1、CYP9J5、CYP6Z3、CYP9M1以及 CYP6P4均呈現顯著表達。JEFFREY等［13］研究表明CYP9M10在蚊蟲對擬除蟲菊酯耐藥性中一直被過度表達。以上研究可以充分證明P450 s基因的點突變、過轉錄和高表達等現象是造成蚊蟲P450 s解毒代謝增強的重要機制。

3.1.2 非專一性酯酶(ESTs): ESTs在蚊蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性中發揮重要作用。編碼 ESTs的基因點突變、擴增和表達量增加是蚊蟲產生抗性的重要分子機制，其中羧酸酯酶起著重要作用。羧酸酯酶是自然界多數昆蟲體內含有的一類重要解毒酶系，其主要是利用水解蛋白和結合蛋白這兩種主要方式對藥劑進行解讀，而隨著代謝解毒過程的進行，抗性也往往隨著羧酸酯酶活力的升高而產生，羧酸酯酶活力測定在如今應用較多的擬除蟲菊酯類殺蟲劑的代謝中發揮著尤為重要的作用［14］。國內已有部分研究表明蚊蟲抗性機制與羧酸酯酶有一定聯系，徐建敏等［2］研究發現白紋伊蚊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的代謝速率與其體內羧酸酯酶的活性高低存在一定的聯系，吳能簡等［15］研究發現隨著羧酸酯酶活性的上升，白紋伊蚊對于氯菊酯的抗性水平也有一定的提高。

國外也有相應研究，FAUCON等［16］研究表明，泰國抗擬除蟲菊酯類殺蟲劑品系的埃及伊蚊體內的3個羧酸酯酶(CCEae3a、CCEae4a和CCEae6a)均發生了變異。POUPARDIN等［17］在泰國研究發現:在埃及伊蚊各種群中擴增水平較高的擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的那空沙旺(NS)種群中，抗性品系CCEae3a比敏感品系表達上調了60多倍，此外，CCEae6a表達也存在上調的現象，CCEae3a的測序和模擬結構預測顯示:NS種群抗性增加與幾種氨基酸的多態性也有一定關系。這些研究進一步證明由于編碼基因擴增造成的羧酸酯酶表達上調，是蚊蟲解毒代謝增強的重要機制。

3.1.3 谷胱甘肽S－轉移酶(GSTs): GSTs是一種多功能解毒酶系，可參與多種有毒物質的解毒代謝過程。目前，蚊蟲 GSTs分為7個亞族，其中 Delta和Epsilon是蚊蟲特異性亞族，已鑒定的蚊蟲抗藥性相關基因主要分屬于這2個亞族［18］。GSTs可以參與蚊蟲對于擬除蟲菊酯類藥劑的抗性產生過程，在非洲中、西部，DDT和氯菊酯交叉抗性的致死按蚊中也發現GSTE2高水平表達，并通過全基因轉錄組的功能分析、結構種群遺傳學的研究，證實其高表達是由GSTE2的單氨基酸(L119F)改變聯合轉錄增加造成［19］。此外，據 JONES 等［20］研究表明，布基納法索城區內對 DDT產生抗性的阿拉伯按蚊(An.Arabiensis)體內的GSTD3表達上調，通過這一研究可以證明GSTs基因表達上調是導致GSTs解毒代謝增強的主要機制。

3.2 靶標抗性 鈉離子通道是幾種神經毒劑的分子靶標，這些神經毒劑具有高度的親和性與選擇性，可以與鈉離子通道專一的結合位點結合而改變鈉離子通道的功能。神經毒理學研究表明:擬除蟲菊酯引起神經興奮性毒性是因為延遲神經細胞鈉離子通道的關閉，也就是擬除蟲菊酯占領鈉離子通道結構域Ⅱ和Ⅵ的S6片段(位于鈉離子通道內外兩側之間的疏水性區域)，從而延遲鈉離子通道的失活過程，產生持久的活化，導致重復后放并阻斷了神經傳導。NATAHASHI等［21］研究表明擬除蟲菊酯類殺蟲劑主要作用于蚊蟲的鈉離子通道，引起鈉離子通道內氨基酸結構發生一定變異，從而延緩了鈉離子通道的關閉，使鈉離子不斷向內流失，進而引起蚊蟲神經沖動的重復后放，與此同時還阻斷了突觸傳遞的進行。

劉宏美等［22］利用PCR以及AS-PCR等技術研究發現淡色庫蚊kdr基因突變與溴氰菊酯抗藥性發生存在一定關系。SINGH 等［23］利用 PCR(PIRA-PCR)技術，對印度地區53個淺色按蚊體內的SC靶標(L1014的ⅡS6結構域)進行了DNA測序，結果顯示在亮氨酸1014的第3密碼子上，明顯存在著2個非同義突變:A＞C與A＞T，兩種突變直接導致亮氨酸(TTA)被替換成苯丙氨酸(TTT或TTC)，三種等位基因TTA、TTT和TTC的發生頻率分別為0.14、0.19和0.67，由此結果可以求得編碼苯丙氨酸等位基因發生頻率為0.86。此外，淺色按蚊亮氨酸kdr基因座中的A＞C突變比A＞T突變具有更加重要的意義，由此可以直接證明蚊蟲靶標抗性的產生與靶標SC上的點突變引起的關鍵部位氨基酸交換存在密切關系。王學軍等［24］研究發現野外種群淡色庫蚊對溴氰菊酯抗性水平與kdr等位基因頻率存在顯著的相關性，然而高效氯氰菊酯、氯氰菊酯抗性水平與kdr等位基因頻率無顯著相關性，存在一定差異。

3.3 表皮抗性 表皮抗性的發生機制主要是由于蚊蟲自身表皮的影響，導致藥劑穿透表皮效率降低，延長藥劑作用到靶標部位的時間，從而降低了藥劑在蚊蟲體內的有效濃度，時間一長便引起了蚊蟲的抗性。表皮抗性與蚊蟲抗性代謝存在一定的正相關性，主要是由于蚊蟲表皮的增厚可以使其容納下藥劑中更多的酯類成分，對于藥劑的穿透起到了一定的限制作用，對于其提升抗藥性起到了一定的促進作用。近年來，FANG等［25］研究發現在淡色庫蚊的溴氰菊酯抗性品系和敏感品系中，通過蛋白質組學和轉錄組發現了14種表皮蛋白(ICPs)，接著通過 qRT-PCR檢測發現無論是實驗室種群還是野外種群，抗性品系的CpCPLCG5基因的表達水平均遠遠高于敏感品系，但是其余13種表皮蛋白均表現下調現象。另外，用小干擾RNA(siRNA)敲除 CpCPLCG5基因時發現抗性品系的敏感性明顯增強，然而其他13種表皮蛋白卻又表達出上調的現象，從而可以表明淡色庫蚊表皮抗性的產生與其表皮蛋白的表達上調存在明顯關系。另外，李慶鳳［3］對淡色庫蚊 SS品系和 CR品系的幼蟲和成蚊的抗性進行了測定，結果表明幼蟲的抗性要明顯高于成蟲，探究發生原因可能是由于幼蟲與成蟲體內代謝水平和對外界環境的適應程度存在一定差異，幼蟲由于長期生活在水中，隨著通過表皮滲透進的藥劑有效成分的增多，幼蟲對藥劑也逐漸適應，進而產生了較高水平的抗性，而成蟲由于接觸部位以及表皮厚度不如幼蟲等因素，表現出來的抗性水平可能就不如幼蟲。

4 討論

由于早期人類大量使用殺蟲劑的原因，如今蚊蟲抗性問題已成為一個世界性難題，所以對蚊蟲進行室內風險評估工作和抗性機制的研究顯得格外重要。國外學者HARDSTONE等［26］研究表明蚊蟲抗性產生不僅僅是單一作用，還可能存在不同抗性機制間的相互作用，且LIU等［27］研究表明殺蟲劑的易感性變化水平不應基于單一的評估方法，由此可見蚊蟲抗藥性問題研究較為復雜。但是隨著人們對于分子生物學研究的不斷深入，對于蚊蟲抗性的產生，發展過程也開始從基因層面進行深入探索，對蚊蟲抗性品系基因的分離、克隆以及表達差異等方面的鑒定，可以很好的從分子角度研究蚊蟲抗性產生機制。然而目前國內外關于蚊蟲抗性遺傳方式的系統性研究報道較少，因此開展相應藥劑抗性風險評估工作以及抗性機制的研究工作對于開展抗性治理具有重要的指導意義。

［1］劉維德.我國蚊類抗藥性發展動向［J］.中國媒介生物學及控制雜志，1990，1(1):41 －44.

［2］徐建敏，梁雪瑩，嚴子鏘，等.白紋伊蚊對3種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性調查［J］.中華衛生殺蟲藥械，2014(5):439－440.

［3］李慶鳳.淡色庫蚊抗氯氰菊酯機理及防治研究［D］.上海師范大學，2015.

［4］寇景軒，劉宏美，公茂慶.淡色庫蚊對常用殺蟲劑長期選育的抗性水平及交互抗性［J］.寄生蟲病與感染性疾病，2013，11(4):176 －179.

［5］李向東，李士根，章洪華，等.淡色庫蚊敵敵畏抗性和氯氰菊酯抗性品系對常用化學殺蟲劑的交互抗性［J］.國際醫學寄生蟲病雜志，2015，42(2):74－76.

［6］宋鋒林，趙彤言，董言德，等.淡色庫蚊與擊倒抗性(kdr)相關的鈉通道基因突變［J］.寄生蟲與醫學昆蟲學報，2005，12(2):93 －98.

［7］劉洪霞，冷培恩，徐勁秋，等.白紋伊蚊對溴氰菊酯的抗性選育及抗性風險評估［J］.中華衛生殺蟲藥械，2015，21(2):125－127.

［8］曹俊，高琪，周華云，等.嗜人按蚊溴氰菊酯抗性機理初步研究［J］.中國寄生蟲病防治雜志，2003，2(2):10－11.

［9］LIU N N，LI T，WILLIAM R R，et al.Multiple Cytochrome P450 Genes: Their Constitutive Overexpression and Permethrin Induction in Insecticide Resistant Mosquitoes，Culex quinquefasciatus［J］.PloS one，2011，6(8):817 －825.

［10］STEVENSON B J，PIGHATELLI P，NIKOU D，et al.Pinpointing P450s Associated with Pyrethroid Metabolism in the Dengue Vector，Aedes aegypti:Developing New Toolsto CombatInsecticide Resistance［J］. Plos Neglected Tropical Diseases，2012，6(3):e1595.

［11］KASAI S， KOMAGATAO， ITOKAWA K， etal.Mechanisms ofPyrethroid Resistancein theDengue Mosquito Vector，Aedes aegypti:Target Site Insensitivity，Penetration，and Metabolism［J］.PLoS Neglected Tropical Diseases，2014，8(6):e2948.

［12］Toé K H，SAGNON N，Dabiré R K，et al.The recent escalation in strength of pyrethroid resistance in Anopheles coluzziin West Africa is linked to increased expression of multiple gene families［J］.Bmc Genomics，2015，16(1):1－11.

［13］JEFFREY G S，MELISSA H Y，SHINJI K.Pyrethroid resistance in Culex pipiens，mosquitoes［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，2015，120:68 －76.

［14］任娜娜，謝苗，尤燕春，等.羧酸酯酶及其介導昆蟲抗藥性的研究進展［J］.福建農林大學學報(自然版)，2014，43(4):337 －344.

［15］吳能簡，陳偉文，吳崧霖，等.深圳市坪山新區白紋伊蚊對氯菊酯的抗性及羧酸酯酶活性研究［J］.實用預防醫學，2016，23(9):1123 －1125.

［16］FAUCON F，DUSFOUR I，GAUDE T，et al.Identifying genomic changes associated with insecticide resistance in the dengue mosquito Aedes aegypti by deep targeted sequencing.［J］.Genome research，2015，25(9):1347.

［17］POUPARDIN R，SRISUKONTARAT W，YUNTA C，et al.Identification of carboxylesterase genes implicated in temephos resistance in the dengue vector Aedes aegypti.［J］.PLoS neglected tropical diseases，2014，8(3):e2743.

［18］DAN Z，LIU X，YAN S，et al.Genomic Analysis of Detoxification Supergene Families in the Mosquito Anopheles sinensis［J］. PlosOne，2015，10(11):e0143387.

［19］RIVERON J M，YUNTA C，IBRAHIM S S，et al.A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector［J］.Genome Biology，2014，15(2):R27.

［20］JONES C M，Toé H K，SANOU A，et al.Additional Selection for Insecticide Resistance in Urban Malaria Vectors:DDT Resistance in Anopheles arabiensis from Bobo-Dioulasso，Burkina Faso［J］.Plos One，2012，7(9):e45995.

［21］NATAHASHI T.Neuroreceptors and ion channels as the basis for drug action:past，present，and future［J］.Journal of Pharmacology ＆ Experimental Therapeutics，2000，294(1):1 －26.

［22］劉宏美.蚊媒擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性現場分子檢測方法的研究［D］.濟南大學，2013.

［23］SINGH O P，DYKES C L，SHAMA G，et al.L1014F-kdr mutation in Indian Anopheles subpictus (Diptera:Culicidae)arising from two alternative transversions in the voltage-gated sodium channel and a single PIRA-PCR for their detection［J］.Journal of Medical Entomology，2015，52(1):24－27.

［24］王學軍，康殿民，趙志剛，等.山東省不同地理種群淡色庫蚊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性及其kdr等位基因頻率相關性研究［J］.現代預防醫學，2016，43(15):2716－2720.

［25］FANG F，WANG W，ZHANG D，et al.The cuticle proteins:a putative role for deltamethrin resistance in Culex pipiens pallens［J］.Parasitology Research，2015，114(12):4421－4429.

［26］HARDSTONE M，LEICHTER C，SCOTT J.Multiplicative interaction between the two major mechanisms of permethrin resistance， kdr， and cytochrome P450-monooxygenase detoxification，in mosquitoes［J］.Journal of Evolutionary Biology，2009，22(2):416 －423.

［27］LIU H，LU Y，LIU Q，et al.Comparison of pyrethroid resistance in adults and larvae of Culex pipiens pallens(Diptera:Culicidae)from four field populations in China［J］.Journal of Economic Entomology，2013，106(1):360－365.