大鼠無創傷氣管插管心肌缺血再灌注損傷實驗的探索與實踐

劉 芬，張大威，呂文偉，李一帆，張志剛*

（1.吉林大學基礎醫學院機能實驗中心，長春 130021；2.長春中醫藥大學解剖教研室，長春 130117）

醫學是一門實踐性較強的學科，實驗教學是整個醫學教育的重要組成部分，是整個教學過程中不可缺少的教學形式，在醫學教育中占有重要的地位[1-2]。機能實驗學是醫學的一門重要的實驗學科，它不僅僅是指導學生通過實驗驗證理論知識，而更重要的是培養學生創新能力、科研思維、臨床實踐能力的重要手段[3-4]。隨著醫學實驗教學改革的不斷深入，新的教學模式、教學手段、課程體系不斷脫穎而出[5]。大鼠心肌缺血再灌注實驗作為現代較前沿的科研方法也引入了機能實驗教學的課堂，旨在培養厚基礎、高素質、強能力的新型醫學人才。目前，心肌缺血疾病呈上升趨勢，特別是急性心肌梗死患者死亡率高，嚴重危及人民的身體健康。近年來，隨著醫療水平和技術的發展，溶栓療法應用急性心肌梗死治療，但如何去減輕病人的缺血再灌注損傷，最大可能地挽救心肌、保護心肌細胞功能一直是廣大醫務工作者奮斗目標[6-7]。所以成功建立可靠的心肌缺血再灌注損傷模型及其機制研究至關主要。大鼠心肌缺血再灌注損傷實驗是機能學開展的一項心血管系統綜合性實驗，學生從大鼠麻醉、手術、正常生理指標觀察、模型制備、給藥治療，到取心臟染色、照相、心肌梗死面積測定，取血、測量心肌三酶指標均自行操作，學生通過實驗全面觀察器官系統由正常生理狀態到疾病狀態再到疾病轉歸或回復正常的全過程。調動了學生的積極性和實驗興趣，培養了學生的動手能力和團隊協作精神。

1 目前實驗操作存在的問題

結扎大鼠左冠狀動脈前降支（LAD）形成心肌缺血、梗死是目前國內外公認的模型制備方法[8-11]，該實驗需在呼吸機支持下結扎大鼠左冠狀動脈，缺血30 min 后再灌2 h 制備缺血再灌模型。大鼠常規麻醉、頸部剪毛、切開皮膚、剝離皮下組織、鈍性分離頸部各層肌肉、暴露氣管、剪開氣管行氣管插管，連接呼吸機，見圖1（見插頁四）。由于大鼠頸部手術視野小，對初次操作的學生來說有一定難度，容易造成出血和窒息死亡，大鼠成活率低，觀察不到最終結果，導致實驗失敗。這種傳統氣管插管方法需剪開氣管，損傷性大，也不適合慢性再灌注的實驗觀察[12-14]。同時，該模型的傳統心肌切片染色方法是在空氣中直接拍照，圖片不清晰，梗死面積的測定誤差很大，嚴重影響實驗結果。本研究結合實驗室實際情況和條件，充分利用實驗室資源，反復探索操作技巧，對實驗的某些環節和步驟進行改進和完善，降低操作的難度，使學生更加容易掌握相關操作技術，提高實驗成功率，可在有限的課堂時間內完成教學任務，推動實驗教學改革。

2 大鼠無創傷氣管插管方法改良

用小鼠灌胃針和乳膠管自制大鼠無創傷氣管插管，見圖2（見插頁四），插管方法如下：將固定大鼠的鼠板頭端抬高，左手用紗布將大鼠的舌向左嘴角外上方牽拉出口腔，用手電筒直接照射大鼠頸部前方,經口腔直視下可見大鼠喉腔內有一透亮區[15-16]，清晰可見大鼠聲門裂隨著呼吸開啟與閉合，在聲門裂打開瞬間迅速將自制氣管插管通過喉腔插入氣管。該操作方法主要優勢：1）大鼠無需頸部手術，無創傷氣管插管經口腔、喉腔插入氣管與小動物呼吸機相連，簡化手術步驟，降低手術難度。2）用小鼠灌胃針自制的無創傷氣管插管實用性強，簡單易行，學生容易掌握，而且灌胃針頭部圓潤光滑，對大鼠氣管內膜無損傷，可反復多次操作。3）手術大鼠可長期飼養，有利于慢性再灌注的實驗觀察。學生通過兩個實驗操作組進行實踐比較，在傳統組有創傷氣管插管操作中，10只大鼠有3只因分離氣管和插管時出血或窒息死亡；在改革組用自制的無創傷氣管插管操作中，10只大鼠均未出現氣管插管死亡，實驗操作全部成功。通過本實驗方法的改進，降低了實驗操作難度，極大的提高了實驗大鼠成活率及實驗教學效果。

3 心肌拍照及梗死面積測量方法改進

心肌梗死面積的測量是大鼠心肌缺血及缺血再灌注損傷實驗的一個重要指標[17]，而心肌照片的好壞是心肌梗死面積的準確測量的前提。為了提高照片的清晰度及準確度，本研究對心肌拍照方法進行了改進，步驟如下：1）心肌切片（厚度約1 mm左右）TTC染色后先放入5%的福爾馬林中固定，防止染色后的心肌暴露在空氣中氧化導致顏色加深。2）將染色的心肌切片放入盛有蒸餾水的特定器皿中，水的深度剛好高于心肌切片的厚度，使染色后的心肌切片保持清晰，色彩鮮艷，且與空氣隔離，進一步防止染色后心肌的氧化。3）應用BI-2000圖像分析系統進行心肌梗死面積的測量及統計，實驗結果準確可靠（見圖3、圖4）（見插頁四）。此方法已經推廣應用到大鼠腦缺血及再灌注實驗中，取得了非常好的效果。

4 結語

隨著機能實驗教學改革的深化，本課題組人員非常重視實驗方法和操作技術的革新，通過多年的實驗教學經驗積累和操作技術的摸索，創新性的研究出大鼠無創傷氣管插管心肌缺血再灌注損傷實驗方法，避免了創傷氣管插管對大鼠的損傷，極大的提高了模型大鼠成活率和實驗成功率。該實驗操作方法簡單，容易掌握，實用性強，學生在實驗教學和相關科研中取得了滿意的效果[18]。該實驗的有效開展為基礎實驗教學與臨床科研實際相結合奠定了良好的實驗基礎，有利于學生早期接觸臨床科學研究，接受科研熏陶，提高分析問題、解決問題的能力[19-20]。同時，本研究提出的改良后的拍照方法及BI-2000圖像分析系統的應用，極大的提高了照片的清晰度及準確性，減小了實驗誤差。