干細胞治療潰瘍性結腸炎的研究進展

王婧穎 唐彤宇

吉林大學第一醫院（長春 130002）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種發病機制未明的慢性非特異性炎癥性疾病，主要累及結直腸。由于生活方式的逐漸西化，UC在我國的發病率也逐漸增高。臨床上常用的為傳統的漸進式療法，即5-氨基水楊酸制劑——糖皮質激素——免疫抑制劑——生物制劑。但傳統療法藥效持續時間短，長期應用副作用大，生物制劑價格昂貴，并且有報道顯示即使運用以上的結合療法在16周內未達成臨床緩解的UC患者仍高達60%，這成為臨床上的一大難題。

干細胞是一種具有自我更新，高度增殖，多向分化潛能的細胞。由于其較強的對腸道黏膜的增值修復能力，以及其對于UC患者混亂免疫系統的調節與重建能力，都是其它傳統療法所不可替代的，在未來將有良好的發展前景。本文將對新興干細胞對于UC的治療作一綜述。

1 腸道干細胞

腸道干細胞是成體干細胞的一種，位于腸道黏膜隱窩基底部，通常情況下，其不斷增值與分化，向隱窩頂部進行遷移，所以腸道黏膜每3～5天即更新一次。腸道干細胞能夠分裂為一個與原始細胞一樣的子細胞和一個有分化能力的子細胞，后者分化為不同種類的腸道細胞：杯狀細胞，潘氏細胞，內分泌細胞，M細胞和腸吸收細胞。

1.1 腸道干細胞的作用機制腸道干細胞雖然與腸道其它細胞的功能差異較大，但其與其他腸道細胞在直接鑒別上仍有較大的困難。在過去的40年里，有兩種理論較為完善。一種是LEBLOND等提出的“干細胞區域”模型，認為隱窩基底部的柱狀細胞（crypt base columnar cells，CBCs）即為腸道干細胞，蛋白Lgr5，蛋白Rnf43和蛋白Troy被認為是CBCs高表達的幾種標記物［1-3］。另一種是POTTEN提出的“+4模型”，認為干細胞位于潘氏細胞之上并且被16個細胞環狀包圍，基因HOPX和LRIG1被認為是辨別的標記［4］。

許多信號通路對于腸道干細胞都有重要的調節作用。這其中包括 Wnt（Wingless）和 Hh（Hedgehog）信號通路，它們與腸道干細胞的增值密切相關。Wnt信號是哺乳動物中促進腸道干細胞自我更新和再生的主要動力信號，TIAN等［5］認為其可能通過非自主途徑，即激活腸上皮吸收細胞的Wnt信號通路來抑制腸道干細胞JAK-STAT信號的表達，從而使腸道干細胞的增值停止。Bmp和Notch通路是腸道干細胞維持自穩態和處理過去損傷。有研究觀察到Notch的丟失導致Lgr5+干細胞的減少伴隨有短暫性的分泌細胞的增生［6］。微環境對于腸道干細胞的調控也十分重要。Athiyyah建立暴露于致病性大腸埃希菌（血清型O55：B5）的大鼠模型，發現植物乳桿菌IS-10506能夠激活腸道干細胞使得其產生明顯的抗炎效果［7］，這說明腸道菌群等微環境也能夠影響干細胞的活動。

1.2 腸道干細胞治療UC腸道干細胞因為其數量稀少，分布不集中，缺乏高度特異性的標記物，其特異性的蛋白Lgr5被證明只存在于部分腸道干細胞表面且與特異性抗體結合困難，不易識別，而其他標記物均位于胞內，缺乏規模化的識別方法，所以其移植案例較為稀少，且局限于動物實驗，缺乏大規模臨床實踐。例如：國內高月秋等［8］用粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，CSF）治療吲哚美辛誘導的炎癥性腸病大鼠模型，發現與對照組相比，G-CSF處理的大鼠腸道干細胞數量明顯增多，而顯示出對腸黏膜的修復作用，恢復腸道功能。YUI等［9］用蛋白Lgr5作為標記篩選出腸道干細胞后體外誘導增值成為腸道“微器官”，移植于UC小鼠腸道內，發現移植物緊貼于腸壁損傷處并產生和腸上皮相同的富含多種細胞的正常組織。這說明其具有良好前景，但仍需攻克多量難題。

2 造血干細胞（HSCs）

HSCs是成體干細胞的一種，存在于骨髓，血液和臍帶當中。HSCs具有高度增值和多向分化的潛能且在骨髓清除術后依舊能夠保持完整的造血功能。HSCs不但能夠分化增值為不同的血細胞系，而且在某些特定情況下，能夠向某些非造血細胞轉化，這稱為HSCs的可塑性。

2.1 造血干細胞的作用機制HSCs的移植對于UC的治療作用目前尚不明確，可能與如下機制有關：（1）HSCs移植后隨血液流動到受損的腸黏膜處，有可能滯留誘導分化為腸黏膜細胞［10］。（2）HSCs與腸道干細胞同為成體干細胞的不同種類，可能其為腸道干細胞提供受損后無法補充的細胞因子與維持微環境所必須的各項物質。（3）HSCs能夠分化成為T細胞和B細胞的各種亞型，進而影響甚至重建機體的免疫系統，從而解決炎癥細胞功能失調及免疫應答時間過長等引起UC的病因。

2.2 造血干細胞的應用HSCs的移植可依據來源不同分為骨髓HSCs移植，外周血HSCs移植和臍帶HSCs的移植以及自體和異體移植。

HSCs單純用來治療UC的研究比較少見，其通常用來治療嚴重血液疾病合并炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）。這主要因為大部分HSCs的治療涉及到清髓以及配型問題，產生的并發癥，如移植失敗，移植物抗宿主病，感染，肝靜脈閉塞，腸道潰瘍加重等問題，限制了其應用。而且對于自體移植的患者來說，免疫系統很可能在“重啟”后的短暫時間里就重新回復到以前病態的炎癥系統中，從而失去移植的意義。RABIAN等［11］回顧分析了全國性的血液系統惡性腫瘤合并IBD的患者進行同種異體造血干細胞移植的病例，發現其48個月的總生存率與對照組而言并無明顯差異。MEHTA等［12］甚至在全國性大樣本的分析中認為HSCs的移植會提高UC的死亡率，并且如果UC患者合并有原發性硬化性膽管炎或結核菌以及巨細胞病毒感染，則移植后死亡率將進一步提高。這與以往一些小樣本的報道結果有著較大的出入。

臍帶HSCs的移植因為臍帶HSCs的表面抗原性弱，所以避免了骨髓清除術和免疫配型的高昂花費以及各種并發癥，相對來說較為安全。張怡等［13］對于重度燒傷造成心臟損傷的大鼠進行臍帶干細胞移植，發現其可顯著降低重度燒傷大鼠心臟中中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤程度，說明其具有良好的抗炎保護組織的作用。江學良［14］對11例激素抵抗的UC患者進行非清髓臍帶HSCs的治療，發現其臨床癥狀如膿血便，腹瀉等癥狀有明顯緩解，腸鏡下結腸粘膜潰瘍明顯愈合，無明顯不良反應及并發癥，是安全有效的治療。

KARACA等［15］報道了1例對于患有家族性白細胞介素-10以及其受體缺乏的11個月大的IBD女性患兒進行早期同種異基因骨髓造血干細胞移植，發現移植后患兒慢性腹瀉，肛周膿腫，以及反復性感染等臨床癥狀完全消失。

3 間充質干細胞

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是成體干細胞的一種，是目前最廣泛用于治療UC的干細胞之一。MSCs的來源十分廣泛，骨髓，脂肪組織，外周血，臍帶以及臍帶血中都有存在。其中應用作為廣泛的是骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）。不同來源的MSCs在功能及篩選方式上相差不大，但也有一定區別，相比于BMSCs來說，臍帶來源的MSCs的含量更高，免疫原性更弱，狀態更為原始，自我增殖和多向分化能力更強，但其需要對產婦及其家屬做好動員工作。脂肪組織來源的MSCs相比于BMSCs來說，不需進行骨髓穿刺等操作，取材容易，來源豐富，但臨床研究相對較少，技術不完善。

3.1 MSCs的作用機制MSCs被廣泛用于治療UC有如下幾個原因：（1）不論自體或異體MSCs移植均不需要清髓或配型處理，因為它只在細胞表面表達低水平的Ⅰ型HLA抗原并且不表達Ⅱ型HLA抗原和T細胞輔活化因子，即不表現出免疫活性。（2）MSCs來源廣泛，體外培養易于甄選分離，國際干細胞治療學會制定了鑒別MSCs的最低標準：體外標準條件培養下貼壁生長；表達CD105，CD73和CD90：不表達CD45，CD34，CD14或CD11b，CD79a或CD19；在體外區別于成骨細胞，成軟骨細胞和脂肪細胞［16］。（3）良好的自我增殖和多向分化潛能，其可誘導分化為脂肪細胞，成骨細胞，軟骨細胞，骨骼肌細胞，特定情況下還可分化為肝細胞，心肌細胞和神經細胞。（4）歸巢特性，即當機體受損后，MSCs能夠感受靶器官的損害，從而自動遷移至受損部位進行修復。曹丹等［17］利用慢病毒載體介導的綠色熒光蛋白技術對BMSCs進行標記，將其移植于UC大鼠內并進行追蹤，發現其明顯歸巢于受損的結腸組織。侯曉琳等［18］利用PKH67標記脂肪組織來源的MSCs，發現其同樣的歸巢特性。（5）MSCs能夠參與血管再生。MSCs移植歸巢于受損組織后，通過分泌多種促血管活性物質（如可溶性的血管生長因子）誘導血管內皮細胞進行增值和遷移，從而促進新生血管形成，對組織進行修復。CARSTENS等［19］在手部發生缺血性壞死患者中進行脂肪組織來源的MSCs的移植，發現其能夠產生血管內皮生長因子，產生原位血管重建，顯著改善患肢缺血情況。MIN等［20］利用脂肪來源的間充質干細胞，使其過表達粒細胞趨化蛋白2和細胞機制衍生因子-1α，來治療缺血性下肢模型，發現其能夠調節血管再生相關的重要因子如血管內皮生長因子受體，從而展現出強大的血管再生而改善缺血的作用。（6）MSCs具有免疫抑制性。這一特性不僅體現在其較弱的免疫原性上，并且其通過細胞間直接的交互作用和分泌可溶性細胞因子來對機體的特異性和非特異性免疫產生抑制作用。其可以通過誘導分裂停滯無反應性來抑制T細胞，B細胞，自然殺傷（natural killer，NK）細胞和樹突狀細胞（dendritic cells，DC）的增值。VAN DEN BERK等［21］的研究發現臍帶血間充質細胞能夠通過前列環素E2的釋放來對DC的增值產生明顯的抑制作用。同時，其對免疫細胞的功能也產生抑制作用，如抑制T細胞和NK細胞的細胞因子分泌和細胞毒性，B細胞的成熟和抗體分泌，DC的成熟和活化以及抗原的呈遞。它還能招募調節性T細胞（regulatory T cells，Treg），YAN 等［22］認為暴露于MSCs的Treg細胞能夠表現出更強的免疫抑制性，這種放大效應可能與MSCs能夠上調Treg細胞表面的細胞程序性死亡受體-1有關。MSCs也可以通過釋放細胞因子作為旁分泌的中介信號來影響免疫系統，如白細胞介素-10，轉化生長因子-β，吲哚胺2，3-二氧化酶，腫瘤壞死因子α刺激基因-6，這些細胞因子均能夠抑制T細胞而增強Treg細胞的增殖［23］。（7）MSCs能夠抑制腸壁纖維化。UC患者因為長期慢性的炎癥反復刺激，病情反復發作，遷延不愈，易導致腸壁纖維化，結腸縮短，腸腔狹窄，順應性減弱，鋇劑灌腸呈現典型的“鉛管樣”改變。眾多研究均表明MSCs有明顯的抗纖維化作用。唐衛平等［24］運用脂肪來源的MSCs移植治療大鼠肝纖維化，發現其可以上調肝細胞生長因子的表達，緩解肝纖維化。吳樹才等［25］利用人胎盤MSCs治療小鼠肺纖維化，發現其可明顯抑制肺組織纖維化的形成。盡管現在尚無直接對于腸道纖維化的研究，但我們相信其具有廣闊前景。（8）MSCs易于轉染目的基因，實現特定的醫學需求。如干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）能夠增強MSCs的免疫抑制功能，所以CHEN等［26］將表達IFN-γ的質粒轉染到MSCs中，發現其自我分泌的IFN-γ增強了其原有的功能，更能有效作用于病灶。

3.2 間充質干細胞的應用ZHANG等［27］運用脂肪組織來源的MSCs移植于UC大鼠，發現MSCs能夠改變微小RNA-1236（microRNA-1236，miRNA-1236）的表達，miRNA-1236能夠下調在UC發病中起到關鍵作用的視黃酸相關孤核受體γ，所以起到顯著地緩解UC的作用。SONG等［28］將犬脂肪間充質干細胞移植于人工誘導的IBD小鼠模型腹腔中，發現其能夠產生腫瘤壞死因子誘導蛋白，從而誘導小鼠巨噬細胞表型轉變為M2型，從而緩解IBD。另一項研究發現利用人臍帶間充質干細胞分泌的外泌體（一種細胞分泌的微小囊泡，含有某些有效的結構成分）能夠緩解UC小鼠的病情［29］。CHEN等［30］運用BMSCs治療IBD小鼠模型，發現相比于對照組，BMSCs能夠降低炎性細胞因子（如腫瘤壞死因子-α，白細胞介素-1β和白細胞介素-6）的表達，并且下調轉錄激活因子STAT3的磷酸化來減緩IBD的腫瘤發生，這說明其對于UC的高癌變率有一定的預防作用。

許多研究證明一些物質能夠加強MSCs的作用效果。TANG等［31］比較了G-CSF和MSCs的結合療法與單純運用MSCs治療UC大鼠模型的療效。發現單純靜脈內注射MSCs移植療法對于UC的臨床癥狀有所緩解，而G-CSF能夠顯著加強MSCs的抗炎效應，提高治療效果。FUENZALIADA等［32］發現經聚肌苷酸胞苷酸處理的臍帶MSCs相比于未處理過的MSCs而言，極化效應更為明顯，能夠加強MSCs的炎癥抑制作用，加強保護腸道作用，提高療效。

SAGYNBAEVA等［33］對UC患者進行BMSCs移植治療，發現在慢性復發性和持續復發性UC患者的緩解期持續時間均有所延長，證實MSCs的移植相比于傳統免疫移植療法來說，在緩解UC活動性和降低自身抗體集中度方面更勝一籌。HU等［34］對34例中重度潰瘍性結腸炎患者進行人臍帶血MSCs移植，發現相比于給予基礎治療的對照組而言，移植組患者反應良好，彌漫性，深部潰瘍及廣泛的腸道炎癥均有明顯改善，Mayo評分顯著下降，且沒有出現明顯的不良反應。另外有眾多報道認為MSCs對于肛周克羅恩病有著良好的療效［35］。

KNYAZEV等［36］在輕癥和重癥UC患者中進行單純標準化抗炎治療和標準化抗炎治療結合MSCs移植的方法療效的對比實驗，結果表明：在UC的急性發作階段，MSCs的應用能夠提高傳統抗炎治療的效果。他的團隊還對MSCs移植后患者作了長達5年的隨訪，發現103例IBD患者（其中56例UC患者）與對照組（經過除抗TNF-α的治療的傳統療法患者）相比，在急性輸血后反應，感染性并發癥，慢性炎癥性疾病的加重，惡性腫瘤和其他致命性事件的發生率并無顯著性差異，證明了MScs移植的安全性［37］。還有一項有趣的病例報道，一位感染了巨細胞病毒的UC患者在未進行任何抗病毒治療的前提下進行BMSCs的移植后，發現UC緩解的同時巨細胞病毒的感染也不治而愈［38］，這說明MSCs在體內不僅能夠抗炎而且具有抗病毒和抗菌的效用，這為難治性UC的治療提供新思路，因為巨細胞病毒的伴隨感染是難治性UC的重要原因。

4 展望

各種干細胞對于UC的治療均顯示出了一定的治療作用，尤其對于傳統方法無效或者無法接受副作用的患者來說，是一個新的希望，說明干細胞的應用在未來的歲月里有著良好的前景，理應得到更多的科研工作者和臨床醫師的重視。但是干細胞應用仍舊存在許多問題。干細胞的選擇受到各種如供體來源，培養方法以及臨床應用經驗的缺乏等客觀條件的限制，沒有明確的種類選擇標準。關于干細胞移植的各種計量計算，移植方法均沒有國際統一的標準。而且現在大量的長期的臨床試驗隨訪工作并不完善，并非所有的臨床試驗都證明干細胞對于UC的有效性，仍舊有許多患者對于干細胞的移植治療表現無效。干細胞移植過程中產生的副作用，尤其是造血干細胞的移植，如細胞栓塞，感染等上文提及的問題，都需要關注。干細胞移植的安全性，如報道干細胞（尤其胚胎干細胞）與某些惡性腫瘤有相關性，干細胞在體內歸巢率低，更多的干細胞滯留在肝臟和肺臟內，產生的效用未明。但是，投入干細胞研究的實驗越來越多，陽性與陰性結果也被頻繁的報道，如果能夠明確其作用機制，解決移植過程中的常見問題，那么干細胞移植治愈UC的道路也近在眼前了。