半微量蒸餾法測定飼料中粗蛋白質含量要點

田 蘊，王益軍，葛 敏，賀 燕，張蘇珍，徐顥瑋，陶 威

（連云港市畜產品質量監督檢驗測試中心，江蘇 連云港 222001）

蛋白質由多種氨基酸組成，是構成細胞、血液、骨骼、肌肉、乳、毛及各種器官組織的主要成分，對生長、發育、繁殖及各器官的修補都是必需的，是生命活動必需的基礎養分。粗蛋白質是含氮物質的總稱，包括真蛋白質和含氮物，粗蛋白質是鑒定飼料質量時必檢的常規營養指標之一，國標GB/T 6432-1994 中采用的是凱氏定氮法，該標準適用于配合飼料、濃縮飼料和單一飼料，其原理是樣品在催化劑作用下，用濃硫酸破壞有機物，使含氮物轉化為硫酸銨，然后加入強堿進行蒸餾，使氨逸出，用硼酸吸收后再用鹽酸標準溶液滴定，測出氮含量，從而計算出樣品中粗蛋白質的含量[1-4]。其操作程序比較復雜，影響因素很多，本文結合實踐經驗以半微量蒸餾法為例，從取樣開始，對每個過程進行詳細解析，指出關鍵影響因素及解決辦法，從而保證檢測結果的準確性。

1 試樣的選取和制備

1.1 要求

選取有代表性的試樣用四分法縮減至200 g，粉碎后全部通過40目篩，裝于密封容器中，防止試樣成分的變化。

1.2 影響因素

1.2.1 采樣人員

采樣應該由受過適當培訓并有飼料采樣經驗的人員執行，采樣應做到隨機、客觀，避免人為和主觀因素的影響，代表性采樣的目的是從一批產品中獲得小部分樣品，而測定這小部分樣品的任何特性均可代表該批產品的平均值。

1.2.2 樣品量

要得到能代表整個批次產品的樣品，就必須設置足夠的分樣數量，根據批次產品數量和實際采樣的特點確定需采的份樣數量和重量，重量應≥2 kg。

1.2.3 分樣

將各個取樣點采集的樣品置于干凈、平整的鐵板上，堆成圓錐形，用干凈的樣鏟將樣品轉堆混勻；轉堆操作時，樣品不得從樣鏟側面下落，必須做到樣品自圓錐頂尖落下，均勻地沿錐尖散落，注意不能使圓錐頂尖錯位；如此反復轉堆3次，使試樣充分混勻，然后把圓錐頂尖壓平，用樣鏟自上壓下，把樣品分成大致相等的4 個等分，取任意兩個對角的等分，其余舍棄，重復操作至得到規定的樣品量。

1.2.4 樣品粉碎

一般飼料的樣品顆粒較大，成分復雜，檢測時稱樣量小，如果細度不夠，容易造成稱樣時樣品不均勻，從而引起檢測結果的誤差。過篩時，要注意把粉碎的試樣及粉碎機中殘留的部分清掃后充分混勻過篩；同時還要注意，在粉碎或過篩過程中有些樣品容易產生自動分級，如玉米，其硬質部分常聚集在上面，軟質部分聚在下面，因此粉碎過篩后要重新混合均勻，以減少測量誤差[5]。

1.2.5 樣品保存

過篩后的樣品，要根據樣品的特性選擇合適的容器密封保存。

2 稱 樣

2.1 要求

國標中規定稱樣量為0.5～1 g（精確到0.000 1 g）。

2.2 影響因素

2.2.1 稱樣的準確性

用分析天平準確稱取試樣，精確到0.000 1 g，一式兩份做平行樣。

2.2.2 稱樣量大小

稱取樣品的數量要合適，不能太多也不能太少，一般飼料的稱樣量為0.5 g，粗蛋白質含量≤10%時，稱樣量＞0.5 g，這樣可以避免在滴定時消耗鹽酸標準溶液體積過小，減小誤差，確保檢測結果的準確性。

3 消 煮

3.1 要求

稱取試樣后，加入混合催化劑6.4 g，與試樣混合均勻，再加入硫酸12 mL 和玻璃珠2 粒，置于電爐上加熱，開始小火，待樣品焦化，泡沫消失后，再加強火力（360～410 ℃）直到呈透明的藍綠色，然后再繼續加熱，至少2 h。消化過程發生以下化學反應：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O。

3.2 影響因素

3.2.1 催化劑

催化劑的作用是提高硫酸的沸點，加快有機物分解。催化劑用量減小，則有機物分解速度緩慢，消化容易不完全；催化劑用量加大，易引起消煮液結晶，造成氮的損失。

3.2.2 硫酸

濃硫酸的作用是對樣品進行脫水及碳化。濃硫酸加量不足，容易出現燒干現象，標準中的硫酸用量，可滿足大部分樣品的消解，對于體積大、重量輕的粗飼料、高蛋白飼料或含水量較高的試樣，應適當加大濃硫酸用量，約15 mL，但要注意在后續蒸餾步驟，氫氧化鈉的用量也要相應調整[6]。

3.2.3 消化溫度和速度

消化時速度要緩慢，如果升溫過快，則部分含氮物質來不及轉化成硫酸銨，而以氣體形式損失掉，會造成檢測結果偏低。開始時小火（200～300 ℃）加熱，目的是防止沸騰的液體溢出瓶口或將碳化后的黑色顆粒濺到瓶壁上，導致消化不完全，引起結果偏低，在消化過程中可以小心輕搖液體將黑色顆粒沖到瓶底的硫酸溶液中（小心防燙），以避免消化不完全。

3.2.4 消解時間

消解時間對飼料中粗蛋白測定結果影響很大，消解時間太短，消化不完全，消解時間過長，又會造成氨的損失，都會造成結果偏低，通常一般樣品在消煮液變綠后至少再消化2 h。

4 消煮液的轉移

4.1 要求

將試樣消煮液冷卻，加入蒸餾水20 mL，轉入100 mL 容量瓶中，冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，作為試樣分解液。

4.2 影響因素

4.2.1 消煮液冷卻時間

一般是等冷卻至不燙手時再進行轉移，冷卻溫度不夠時，加入蒸餾水，與熱硫酸發生劇烈反應，易引起燙傷；冷卻時間太長，則消煮液容易結晶，如果出現結晶，可放于電爐上加熱溶解，或放在50 ℃水浴中超聲溶解[7]。也可定容至200 mL 容量瓶中，計算結果時試樣分解液總體積以200 mL計，不影響測定結果[8]。

4.2.2 轉移方法

為了防止消煮液損失，可以在容量瓶上加上漏斗，并用玻璃棒引流，小心地將凱氏燒瓶里的液體轉移至容量瓶中，并按照少量多次原則，用少量蒸餾水多次洗滌燒瓶，全部轉移至容量瓶中，轉移不完全會造成結果偏低。

4.2.3 定容

由于硫酸與水反應會放熱，一定要等到容量瓶中液體冷卻至室溫后再定容，否則會引起定容體積不準確，造成檢測結果不準確。

5 蒸 餾

蒸餾過程發生如下化學反應：2NaOH+（NH4）2SO4=2NH3↑+Na2SO4+2H2O。

5.1 要求

將半微量蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有20 mL 硼酸吸收液和2 滴混合指示劑（甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑）的錐形瓶中，蒸汽發生器的水中應加入甲基紅指示劑數滴，硫酸數滴，在蒸餾過程中保持此液為橙紅色，否則應補加硫酸。準確移取試樣分解液10～20 mL 注入蒸餾裝置的反應室中，用少量蒸餾水沖洗進樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10 mL氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應室，將玻璃塞塞好，且在入口處加水密封，防止漏氣。蒸餾4 min 降下錐形瓶，使冷凝管末端離開吸收液面，再蒸餾1 min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗滌液均流入錐形瓶內，然后停止蒸餾。

5.2 影響因素

5.2.1 冷凝水

冷凝水要在蒸餾開始前開啟，冷卻不完全，易造成結果偏低。

5.2.2 系統密閉性

蒸餾過程中，要求整套裝置呈密閉狀態，不能漏氣，否則易造成氨氣逸出，影響檢測結果。一般要注意以下幾點：蒸餾前應檢查定氮儀各導管間的連接處是否密閉并用硫酸銨進行檢驗；往蒸餾室加樣液之前要把冷凝管末端浸入硼酸吸收液液面以下；樣液加入蒸餾裝置后，要及時水封；加堿液時，堿液尚未流完時，加適量蒸餾水沖洗，并留下少量蒸餾水作水封；整個反應室除了冷凝管路浸在吸收液里，其余管路都保持密封，防止漏氣；防止生成的氨氣揮發[9-10]。

5.2.3 蒸汽中氮元素的控制

為了防止水中的氮元素隨著水蒸汽揮發出來，影響測定結果，在蒸汽發生器里加硫酸，使水中的氮元素轉化成硫酸銨[11-12]。

5.2.4 蒸汽量大小

蒸汽量太大，反應室的液體易沖進冷凝管內，引起結果偏高；蒸汽量太小，蒸餾速度慢，容易發生倒吸，引起結果偏低。

5.2.5 反應室溶液體積

在沖洗加樣時用水量要少，否則反應室溶液體積太大，液面升高，反應室的液體容易沖進冷凝管內，引起結果偏高。

5.2.6 蒸餾時間

蒸餾時間不夠，氨氣未完全蒸餾出來，蛋白質含量偏低；蒸餾時間過長，則會造成時間和資源的浪費，如果樣品含氮量特別高，可以適當延長蒸餾時間。

5.2.7 清洗

每次蒸餾完畢后應先取下接收瓶，再進行清洗，必須徹底清洗蒸餾室，以免再次使用時影響測定結果。

6 滴 定

6.1 要求

蒸餾后的吸收液立即用0.1 或0.02 mol·L-1鹽酸標準溶液測定，溶液由藍綠色變成灰紅色為終點。滴定過程發生如下化學反應：NH4H2BO3+HCl=NH4Cl+H3BO3

6.2 影響因素

6.2.1 鹽酸標準溶液

標準溶液要按照GB/T 601 配制并標定，在使用前應搖勻。

6.2.2 滴定過程

滴定前要注意排除滴定管底部的氣泡，過程中要邊滴定邊搖動錐形瓶，防止來不及反應，滴定速度保持6～8 mL·min-1，和標定時的滴定速度保持一致。

6.2.3 測定終點的判定

甲基紅-溴甲酚綠指示劑變色范圍為pH 5.0～5.2，pH＜5.0 為暗紅色，pH 5.1 為灰綠色，pH＞5.2為綠色，滴定接近終點時要緩慢加入，仔細觀察溶液顏色的變化，液體顏色變為無色時接近滴定終點，然后再半滴半滴加入，溶液由藍綠色變成灰紅色為終點，保持顏色變化和空白測定顏色一致。

7 空白測定

空白檢測的目的是校正所用試劑帶來的誤差。

7.1 要求

稱取蔗糖0.5 g，代替試樣，按照樣品測定步驟同法操作，消耗0.1 mol·L-1鹽酸標準溶液的體積≤0.2 mL，消耗0.02 mol·L-1鹽酸標準溶液的體積≤0.3 mL。一般做一組平行進行檢測，這樣可以減小試驗測定值與真實值之間的誤差，同時也可以衡量整個試驗操作過程是否正確。

7.2 影響因素

蔗糖是一種有機物，但是又不含氮，所以能被用來代替樣品測試空白，空白樣品滴定消耗鹽酸的量以0.05～0.15 mL為宜，空白值過高的一般是由蒸餾水的純度不夠、所用試劑的純度不夠及所用器皿清潔度不夠等原因造成。

8 蒸餾步驟的檢驗

8.1 要求

精確稱取0.2 g 硫酸銨代替試樣按照蒸餾步驟進行操作，測得硫酸銨含氮量為21.19±0.2%，否則應檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。

8.2 影響因素

在保證加堿、蒸餾和滴定步驟操作正確的前提下，系統的氣密性是關鍵影響因素，因此硫酸銨的測定目的通常是為了檢查半微量蒸餾裝置的氣密性。

9 結果計算

先測出飼料中的含氮量，再根據蛋白質的含氮量計算出粗蛋白質的含量，由于一般蛋白質中含氮量約為16%，所以一般用系數6.25 作為氮換算成蛋白質的平均系數。如果飼料中的含氮量已經確定，可用實際系數來換算，例如蕎麥、玉米用系數6.00，大豆、小麥用系數5.70[5]。