Notch信號通路及其與肝癌相關性的研究進展＊

周 煜，薛淑一，李明春

Notch基因首次由Morgan及其同事于1917年發現，他們觀察到該基因部分功能缺失會造成果蠅株翅膀的邊緣缺刻，因此命名為Notch基因。直到20世紀80年代中期，Artavanis－Tsakonas研究小組才首次克隆出Notch基因。Notch信號通路是一條極其復雜的調控通路，調控機體內多細胞的分化、增殖和凋亡的動態平衡，幾乎涉及所有的器官和組織。因此，Notch信號通路的異?；罨瘜е铝舜罅康娜祟惣膊陌l育綜合征到成人疾病，甚至是多種惡性腫瘤［1－3］。 因此，對其進行深入的研究顯得十分重要。

肝癌是全世界最常見和導致人類高病死率的惡性腫瘤之一［4］，給人類的生命和社會的發展帶來了嚴重的威脅。其中有一半的病例和病死者發生在中國［5，6］，且呈逐年上升的趨勢，中國面臨的肝癌形勢日益嚴峻，也是研究人員重點關注的疾病之一，但目前對肝癌信號通路的研究尚不清晰。因此，深入研究肝癌信號通路，尋找有效治療方法，在肝癌的預防和治療中顯得尤為重要。近年來，Notch信號通路成為肝癌研究的重點和難點，該條信號通路有望成為肝癌治療的新型生物靶點［7，8］。 在此，該文就Notch信號通路的組成，Notch信號通路的調控以及Notch信號通路在肝癌中作用研究做一綜述。

1 Notch信號通路的作用

Notch信號通路廣泛表達于從無脊椎動物到哺乳動物，是一條進化上高度保守的信號通路，它處于復雜的多維調控網絡之中。Notch信號通路在細胞譜系定型、分化、周期進程、增殖、凋亡的過程中起著重要的作用。Notch信號對干細胞和祖細胞的行為有重大影響，并影響其功能［9］。Notch信號通路的活化可以刺激細胞進行表型轉換或阻止進一步的分化來維持原有的表型。Notch信號通路在不同的組織或細胞背景下，有不同的作用，即使Notch信號通路在同一組織中不同時間節點，也表達出不同的角色和行為，這取決于Notch信號通路所處的位置。近年來，越來越多的研究表明，Notch信號通路與腫瘤之間存在著一些聯系，Notch信號通路在許多腫瘤中發生改變，導致在其他致癌信號通路中激活或抑制該通路。Notch信號通路可以促進癌癥細胞生長也可以抑制癌癥細胞生長［10，11］。

2 Notch信號通路的組成

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體（DSL蛋白）、細胞內效應器分子（CSL蛋白）組成。

2.1 受體 果蠅中只有1個Notch受體，線蟲中有2個Notch受體，哺乳動物中有4個同源Notch受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4），Notch 受體為 I型跨膜蛋白，由胞外域（NEC）和胞內域（NTM）組成，胞內域可分為跨膜區（TM）和胞內區（ICN）兩部分。NEC是與配體結合的區域，包含多個表皮生長因子的重復序列 （epidermal growth factor-like repeats，EGF）和三個富含半胱氨酸的LIN12-Notch重復序列（LIN12-Notch repeats）和異二聚體結構域（heterodimerization domain，HD）組成的負性調控區（negative regulatory region，NRR）［12］。 哺乳動物中Notch1和Notch2均有36個表皮生長因子的重復序列，Notch3和Notch4分別含有34和29個表皮生長因子的重復序列。Notch（1~4）受體的差別主要集中在表皮生長因子的重復序列（29~36）上，這些差別是重要的，通過鄰-巖藻糖轉移酶將表皮生長因子的重復序列上特定的絲氨酸和蘇氨酸殘基上巖藻糖基化，這是受體與配體有效結合所必需的［13］。這些O-巖藻糖部分可以通過由N-乙酰葡糖胺基轉移酶的邊緣家族添加N-乙酰氨基葡萄糖來延長，這些修飾增加了Notch受體對某些配體的親和力。Notch受體的11~12表皮生長因子的重復序列與配體的24~29表皮生長因子的重復序列相互作用。許多EGF重復序列結合鈣，其在確定結構和Notch受體對其親和力方面起著重要作用。NRR阻止受體未與配體結合的情況下，獨自活化。NTM在Notch信號通路中發揮著與下游效應蛋白的相互作用、核定位和蛋白質穩定性等關鍵作用，它由RBPJk 關聯分子（RAM）域、核定位序列（NLS）、錨蛋白重復序列（ANK）、轉錄域（TAD）、C 末端含有脯氨酸、谷氨酸，絲氨酸和蘇氨酸豐富的多肽（PEST）域組成。在Notch3和Notch4受體中未發現TAD［14］。PEST域負責調節蛋白的更新，果蠅Notch還富含谷氨酰胺的OPA重復序列。

2.2 配體 哺乳動物中有兩類五種Notch配體，Serrate 樣配體（JAG1、JAG 2），Delta 樣配體（DLL1、DLL 3、DLL 4），它們統稱為 DSL蛋白。 Notch配體同樣為I型跨膜蛋白。Notch配體由N末端的DSL域、串聯EGF重復序列的DOS域、EGF重復序列三部分組成［15］。Serrate樣配體靠近細胞膜的部位有一個富含半胱氨酸的結構域，Delta樣配體無此結構域。DSL和DOS域參與了受體結合，DSL域是Notch信號通路激活所必需的，DSL域還參與了Notch的反式和順式相互作用。DSL域可以基于存在/缺失富含半胱氨酸域和DOS域進行分類。在5種配體中，DLL 3表現出與其他配體明顯的結構差異，在反式體中似乎不能激活Notch信號通路。因此，DLL3激活Notch信號通路的一些功能意義有待于進一步的研究［16］。

2.3 細胞內效應器分子 CSL蛋白［哺乳動物中為CBF-1 （C-promoter binding protein-1）， 果蠅中為Su（H）（Suppressor of Hairless），線蟲中為 Lag1］中的 CBF-1（C-promoter binding factor-1）在哺乳動物中又稱為RBP-JK （recombination signal binding protein-Jk），是轉錄抑制因子，能夠識別并與特定的DNA 序列“GTGGGAA”結合，招募 SMRT，SKIP，Ⅰ/Ⅱ型組蛋白去乙?；傅鹊鞍仔纬晒惨种莆?，防止下游靶基因獨自活化。在Notch信號通路中起關鍵作用。Notch蛋白的活化形式-NICD（ICN）進入細胞核后，ICN中的RAM和ANK結構域與之結合，并招募共激活因子，如操縱子樣蛋白家族（mastermindlike family members，MAML），解除轉錄抑制，激活轉錄［17］。

3 Notch信號通路的激活

Notch信號通路由兩個相鄰細胞的Notch受體與配體相互作用而激活，這是激活Notch信號通路的必要條件。Notch信號通路的激活要經過3次酶切割。Notch受體前體蛋白在核糖體合成以后，在高爾基體內被furin蛋白酶于S1位點進行第一次裂解，形成NEC和NTM兩個亞基，它們通過二硫鍵連接形成異二聚體形式的成熟Notch受體，并轉運至細胞表面，第一次裂解的功能意義仍有待于進一步研究。當受體與配體結合以后，配體誘導的構象改變，TM之前位于12個氨基酸并深埋在NRR內的S2位點被暴露，被腫瘤壞死因子-α轉化酶（tumour necrosis factor-α -converting enzyme，TACE;也被稱為ADAM17）裂解為2個片段，S2裂解是缺口激活中的關鍵調節步驟［18］，N端裂解片段（NEC）被配體細胞所吞噬，C端裂解片段在S3位點被早老素-γ-secretase復合體釋放Notch蛋白的活化形式 NICD（Notch intracellular domain，NICD），早老素-γ-secretase復合體由 presenilin 1 （PSEN1），PSEN 2，nicastrin （NCSTN），presenilin enhancer 2（PEN2）和 APH1 組成［19］，NICD 進入細胞核，激活下游靶基因。NICD通過磷酸化和蛋白酶降解快速失活，該信號通過配體誘導的新的NICD的蛋白水解來維持。沒有第二信使參與擴增Notch信號的傳導，導致Notch信號在細胞傳導過程中沒有增強或減弱，從而使細胞對Notch信號活動的微小變化敏感。

4 Notch信號通路與肝癌

許多研究已經表明，Notch信號通路是雙向調控通路，它在不同的狀態下發揮完全相反的作用，Notch信號通路在不同腫瘤和腫瘤發展的不同階段時，Notch可以作為致癌基因或者抑癌基因，在慢性淋巴細胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL），非小細胞肺癌和結直腸癌中表現出致癌作用［10，20-22］，但在急性髓細胞性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML），鱗狀細胞肺癌和鱗狀細胞皮膚癌中表現出抑癌作用［23，24］。 此外，Notch 在高惡性宮頸癌中低表達而在低惡性中卻高表達。Notch信號在肝癌中起著重要的作用，它調節肝癌細胞的增殖和凋亡。但是，激活Notch信號通路到底是抑制或者促進肝癌細胞生長仍存在爭議，盡管有一些令人信服的證據表明，Notch信號通路的激活，促進肝癌的生長［25］，但一些專家持相反的意見［26］，造成這種沖突的原因，很可能是由于Notch信號通路是細胞背景依賴性的［27］。

Notch信號通路的激活對于膽管板重塑和小管形成是必需的，它們的形成是膽管發育的主要步驟［28］。在Notch信號通路缺失的遺傳病癥中，肝臟核因子 1β（hepatic nuclear factor1β，HNF1β）缺乏，導致膽道細胞無反應及肝膽細胞無法聚集，影響膽道的修復，從而形成Alagille綜合征（Alagille syndrome，AGS），臨床表現為嚴重的膽管發育不良和膽汁淤積以及多種肝外表現，這表明Notch信號通路是人肝臟修復的重要調節因子［29］。在敲除Notch1基因的小鼠中，Notch1的缺失不足以促進肝癌細胞生長，卻促進肝細胞的增殖，導致發展為結節性增生，表明Notch信號通路的抑制了HCC細胞的增殖和肝癌的生長［30］。

對HCC患者進行數據分析，發現Notch1基因高表達的患者有更好的預后。有文獻報道［31］，檢測了Notch受體在肝癌與正常肝組織中的表達，肝癌組織中，Notch1、Notch2、Notch3 的表達下調， 表明Notch信號通路抑制肝癌細胞的生長。

在SMMC7721細胞中，Notch1誘導的生長抑制與 G0/G1細胞周期阻滯，cyclin A，cyclin D1，cyclin E，和 cdk4上調相關［32］。在HepG2肝癌細胞中，Notch1信號通路激活后，p21表達上調，與細胞周期表型分布和生長抑制緊密相關的高度磷酸化的Rb蛋白表達下降，導致G0/G1細胞周期阻滯從而抑制生長。Notch信號通路激活導致G2細胞周期阻滯和細胞凋亡可能與RB家族基因失活使TKO成纖維細胞G2細胞周期阻滯相關［33］。在細胞周期阻滯后，通過p53依賴性途徑，Notch1信號通路減少Bcl-2信號通路傳導，從而誘導細胞凋亡，改變了p53與Bcl-2的平衡，抑或是Notch1信號通路誘導腫瘤壞死因子相關的凋亡配體，誘導肝癌細胞凋亡，從而抑制肝癌細胞生長而發揮抑癌作用［34］。也有文獻報道稱，Notch1的過表達，磷酸化JNK （c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路，從而活化JNKMAPK信號通路，誘導肝癌細胞凋亡，從而抑制肝癌生長。JNK（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路調節凋亡相關基因，包括 Bcl-2、bax［35］。

最近有研究表明，Notch1在肝癌（human hepatocellular carcinoma，HCC）中作為促癌因子，在人肝癌組織中，發現Notch激活表達。在NICD小鼠模型（Notch信號通路中NICD上調）中，Notch1信號通路激活誘導腫瘤發生［36］。Notch1異常表達與HCC轉移性疾病密切相關，并且在Notch1敲除小鼠模型中HCC腫瘤轉移被抑制［37］。在小鼠模型中，Notch2激活時，誘導肝癌細胞增殖并促進肝癌生長［38］。有文獻報道，與正常肝細胞相比，肝癌細胞中的Notch1 高表達，Notch2 與 Notch3 表達無明顯差異［39］。但也有文獻報道，與周圍肝硬化組織相比，腫瘤細胞中Notch1和Notch3的異常核表達［40］。在晚期肝癌階段，細胞周期相關的基因表達上調，Notch信號通路在細胞周期進展中發揮著重要作用［41］。研究表明，Notch1的高表達表明Notch信號通路具有癌變的作用。

在HepG2細胞中，Notch1激活增加S和G2M期細胞的數量，在SMMC7721細胞中，抑制Notch1時，細胞周期阻滯并誘導細胞凋亡，表明Notch1激活促進HCC細胞生長和增殖［42］。有文獻報道，在HCC細胞中，p53過表達，共激活Notch1-Snail信號通路導致侵襲和增殖增加［43］。此外，在HCC細胞中，經由p53依賴性通路，沉默的Notch3增強了阿霉素誘導細胞死亡的敏感性。在SMMC7721細胞中，TNF－α通過IKKα和FOXA2轉錄因子，減少Notch抑制物Numb表達［25］。抑制FOXA2是許多炎癥病癥的顯著特征，可能代表慢性炎癥與癌癥之間的分子聯系。這些研究證據表明，在HCC中，Notch信號通路的致癌作用是依賴于與其他通路 （p53，Snail，TNFα/IKKα/FOXA2/NUMB）的合作，并被炎癥微環境所調節［44］。有許多研究證據表明，在肝癌中，Igf2和Sox9是共致癌部分。在乳腺癌，卵巢癌和結腸直腸癌中Igf2強烈上調，提高了Igf2在這種情況下作為Notch致癌的可能性。在與胚胎干細胞表達轉錄因子Nanog相關的HCC癌癥干細胞中發現了Igf2上調，Igf2啟動子和Igf2上調都是人類HCC公認的特征［45，46］。 Notch 誘導的所有腫瘤中顯示 Notch的靶基因Sox9有不同程度的核染色，并且在人類肝癌中頻繁觀察到Sox9過表達，特別是在Notch誘導的那些腫瘤。最近的一項研究表明，Sox9是肝臟內的多能群體，因此，在肝癌發生過程中，Notch可能通過擴增先前存在的祖細胞或賦予分化細胞祖細胞樣特性而發揮作用［47］。

Notch信號通路促進或抑制肝癌的生長可能是與其他信號通路的串擾的結果，Notch信號通路的激活改變了其他多條信號通路的途徑，其他蛋白又負反饋調節Notch信號通路，導致肝癌細胞增殖，凋亡或促進細胞分化。

綜上所述，Notch信號通路是一條介導細胞與細胞間相互作用來調節生物體生長發育的一條保守的信號通路，在細胞命運決定、胚胎發育、器官組織的形成各個環節起著重要的作用。Notch信號通路與肝癌細胞的增殖、分化、凋亡、密切相關，但是由于Notch信號通路是一條復雜的多維調控通路，Notch信號通路與其他信號通路互相關聯，互相影響，Notch信號通路在肝癌中的具體分子機制仍不清晰，雖然一些Notch信號通路在肝癌中的作用已初步達成共識，但在肝癌發展中的具體作用機制仍有巨大爭議，有些研究認為Notch信號通路在肝癌中有時起抑癌作用，另一些研究認為Notch信號通路在肝癌中有時起促癌作用，所以必須研究清晰Notch信號通路在肝癌中的具體分子機制。隨著現代科技的發展，人們對遺傳學、分子生物學、腫瘤學以及信號通路的不斷研究深入，定會明確Notch信號通路在肝癌中的分子機制，這將為肝癌靶向治療研究開辟新的途徑，為肝癌患者帶來福音。