骨骼肌晝夜節律分子鐘機制的研究進展

閆銀弟 羅旭光 楊艷萍 李海榮 曹錫梅

山西醫科大學（太原 030001）

生物體以時間為周期所表現出的規律性的機體活動變化模式稱為生物節律，又稱近日節律。節律性是從低等的單細胞生物到人類的保守的進化特征［1］，并且參與調控基因的表達［2］。生命活動表現出以24 h為周期的變動稱為晝夜節律［3］。已有的研究普遍認為，晝夜節律受控于中樞下丘腦視交叉上核［4］。該節律由分子鐘驅動，分子鐘存在于生物體幾乎所有的細胞，包括核心鐘基因BMAL1（brain and muscle ARNT?like protein 1）、CLOCK（circadian locomotor output cycles kaput）、Per1/2（period1/2）和 Cry1/2（cryptochrome1/2）。但是關于外周組織晝夜節律的研究相對較少，如骨骼肌和心臟。本文闡述骨骼肌晝夜節律分子鐘機制的相關性研究，將有助于進一步研究骨骼肌發育分化，為維持骨骼肌的健康提供一個新思路。

1 晝夜節律的分子鐘機制

長期以來，多數學者認為中樞下丘腦視交叉上核的晝夜節律控制著外周組織器官的節律性，如骨骼肌，并使其保持同步［5?6］。小鼠眼睛接受光刺激后，通過神經信號傳播到中樞視交叉上核，以分層方式同步中樞和外周分子鐘［7］。當損毀中樞下丘腦視交叉上核后并不會中斷外周組織的晝夜節律，僅使這些組織之間去同步化［8］。已知晝夜節律不僅控制睡眠和清醒狀態、胃排空時間，而且還參與調節心情、認知、感覺敏銳度、呼吸節律、體溫等。循環系統和免疫系統也會受到晝夜節律的調節，如心率和血壓［9］。小鼠肝臟和骨骼肌中的數百種基因具有晝夜節律表達模式［10］。那么中樞晝夜節律和外周組織的功能活動有怎樣的聯系呢？

哺乳動物中大多數轉錄因子以時間依賴的方式激活或者抑制表達基因的靶基因，其中BMAL1、CLOCK、Per1/2和Cry1/2轉錄翻譯反饋機制是核心［11］。作為主要的調節子，BMAL1與CLOCK形成二聚體，結合靶基因啟動子區的E?box（CACGTG）誘導靶基因的表達。如 Period（Per1和Per2）和Cryptochrome（Cry1和Cry2）被BMAL1/CLOCK二聚體激活。反過來Per和Cry形成復合物反饋抑制BMAL1/CLOCK二聚體的活性［4］。分子鐘幾乎存在于生物體所有的細胞，維持正常的晝夜節律對生物體的生命活動具有十分重要的作用。此外，其他調控回路作為補充，進一步鞏固加強分子鐘的功能，包括核受體Rev?erbα（Nr1d1）、Rev?erbβ（Nr1d2）和 RORα（Nr1f1）。BMAL1/CLOCK 二聚體復合物能夠直接誘導上述核受體的表達；核受體Rev?erbα則競爭BMAL1啟動子元件從而控制該基因的節律性表達［12］。缺失 RORα的小鼠表現出異常的晝夜節律［13］。不同的是 Rev?erbα/β激活BMAL1的轉錄而RORα抑制BMAL1的轉錄［4］。分子鐘還能夠通過翻譯后修飾，如磷酸化、乙酰化、泛素化等作用，進一步調節晝夜節律［14］。酪蛋白激酶（CK1ε）、分裂原蛋白激酶（MAPK）和糖原合成酶激酶（GSK?3β）均是分子鐘磷酸化作用的組件，通過泛素化作用能夠控制轉錄的激活與抑制［14］。翻譯后修飾如組蛋白乙酰化或去乙酰化，控制分子鐘方面發揮著重要作用［14］。在小鼠肝臟，組蛋白脫乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）調控靶基因組DNA顯示出周期性節律；核受體Rev?erbα募集HDAC3定位到靶基因保證肝細胞的正常脂代謝，若敲除 Rev?erbα或 HDAC3導致肝脂肪變性［14］；當小鼠缺失Rev?erbα基因導致脂質代謝異常，促進飲食誘導的肥胖并改變誘發糖尿病的血糖和血脂利用之間的平衡［15］。當小鼠禁食時，肝臟和脂肪組織的脂質代謝改變，需要與骨骼肌協同工作，才能維持葡萄糖平衡［14］。

2 骨骼肌發育分化中肌調節因子發揮的作用

肌調節因子（myogenic regulatory factors，MRFs）表達于骨骼肌的成肌細胞，是一組具有堿性螺旋?環?螺旋（basic helix?loop?helix，bHLH）結構的轉錄因子，包括MyoD、Myf5、myogenin 及 Myf?6［16］。該調節因子均含有 E 蛋白，能夠結合目的基因調節區的E?box，在成肌細胞的分裂增殖及分化為成熟骨骼肌細胞中起決定作用。基因敲除小鼠顯示，Myf5和MyoD在肌發育早期發揮作用，賦予中胚層前體細胞肌源性命運［17］；Myf6在肌發育早期和晚期均發揮作用［18］，并在Myf5：MyoD雙敲除小鼠（Myf5：Myod double?null mice）肌源性測定和分化中發揮作用［18］。myogenin是骨骼肌形成過程中關鍵的調節因子，在肌發育晚期發揮作用并呈節律性表達［19］。

骨骼肌細胞的發育分化是多因素參與并受嚴格調控的復雜生物學過程。蛋白精氨酸甲基轉移酶Prmt5發揮作用轉錄激活基因myogenin啟動子區是表達desmin、α?骨骼肌肌動蛋白（sketal α?actin）和骨骼肌細胞分化所必需的［20］。而desmin等骨骼肌標志性蛋白的表達需要骨骼肌調節因子MyoD的激活［21］，MyoD調節肌細胞的分化又依賴于蛋白精氨酸甲基轉移酶Prmt5［20］。為使機體更適應于日常環境的變化，分子鐘驅動的晝夜節律接近于24 h，破壞該節律則有害于骨骼肌的健康［8］；如果晚上嚴格禁食，MyoD和myogenin在骨骼肌的表達顯著上調［19］。然而在小鼠胚胎發育晚期（E16.5d到E19.5d），神經支配的伸長肌MyoD和myogenin下調；神經支配的比目魚肌MyoD下調、myogenin表達水平保持不變［22］。骨骼肌成肌細胞分化過程中許多新基因的有效表達需要myogenin［23］。myogenin基因敲除小鼠的骨骼肌成肌細胞難以分化成正常的肌纖維，并表現為出生后高致死率［24］。可見骨骼肌發育分化過程中肌調節因子是必需的而且其調節具有特殊性。

3 鐘基因BMAL1/CLOCK對骨骼肌肌調節因子的調控作用

骨骼肌是人體的主要器官之一，約占體質量的40%，參與維持姿勢、運動和呼吸。同時，它也是主要的代謝器官，具有內分泌功能，對胰島素敏感［4］。胚胎發育過程中骨骼肌開始形成，出生后進一步發育成熟，具有特殊的收縮功能以及新陳代謝功能［4］。成人骨骼肌可以分為快肌纖維和慢肌纖維，慢肌纖維如比目魚肌和膈肌，含有大量的線粒體，收縮速度慢、收縮力小、持續時間較長，與有氧運動有關；快肌纖維如趾長伸肌，特點與慢肌纖維恰好相反，幾乎不含線粒體，收縮速度快、收縮力較大、持續時間較短。然而，骨骼肌纖維類型是在出生以后才建立，并保留可塑性，受外界刺激調節。運動參與調節骨骼肌功能，耐力運動促進向慢肌纖維轉換，力量運動則促進向快肌纖維轉換。運動還可以控制生物體的能量平衡，影響全身的晝夜節律［25］。提示晝夜節律和骨骼肌健康、正常的功能維持相關。

已知小鼠骨骼肌中至少有215個基因具有晝夜節律表達模式［8，26］，這些基因不僅僅參與構成核心分子鐘，如BMAL1、Nr1d1、Nr1d2、Per2，而且還參與骨骼肌的功能和代謝。利用特異性基因缺失小鼠觀察核心分子鐘基因對骨骼肌的影響：BMAL1?/?小鼠以及 CLOCKΔ19小鼠壽命顯著縮短，提前出現衰老的特征，如肌纖維張力減弱；電鏡觀察可見肌絲結構紊亂、線粒體體積變小［27］。Rev?erbα缺失小鼠表現出運動能力低下，可能與線粒體的發生和活性缺失有關［28］；Per2缺失小鼠的運動耐力和運動能力均降低［4］。特異性誘導小鼠骨骼肌BMAL1缺失導致骨骼肌總重量增加，但是肌力明顯減弱，而BMAL1?/?小鼠骨骼肌的總重量減少［4］。提示鐘基因參與影響骨骼肌的代謝和健康。

有研究表明肌調節因子與分子鐘基因之間存在聯系。野生型小鼠骨骼肌MyoD1的表達呈周期性波動，當突變CLOCK后MyoD1周期性波動消失；若缺失BMAL1，MyoD1的周期性波動也同樣消失［29］。BMAL1/CLOCK二聚體能結合到MyoD1啟動子，誘導MyoD1周期性波動表達［4］。已知MyoD?/?小鼠與BMAL1?/?和CLOCKΔ19小鼠有相似的特點：骨骼肌張力降低、肌絲結構紊亂［26］。BMAL1與CLOCK結合MyoD啟動子區域的核心增強子改變MyoD靶基因的表達，表明MyoD是BMAL1與CLOCK的控制基因［4］。然而BMAL1與CLOCK缺失小鼠的骨骼肌形成正常，提示存在補償機制，如MyoD突變小鼠中觀察到肌調節因子Myf5發揮補償調節作用［30］。觀察馬和斑馬魚的骨骼肌，可見肌調節因子Myf6與BMAL1、CLOCK表達高峰呈現出同步的晝夜節律［31］，提示肌調節因子受鐘基因的調控。BMAL1與CLOCK除參與調控MyoD1的表達，BMAL1還參與Wnt信號通路轉錄控制肌分化［6］。胚胎發育過程中，Wnt信號通路在骨骼肌分化過程中發揮著重要作用，構成鐘基因和肌分化的橋梁［32］。

4 討論

骨骼肌作為人體的主要器官，其結構和功能變化與疾病的發生發展密切相關，如常見的心血管疾病和癌癥都伴隨著骨骼肌質量的減輕、肌力減弱和代謝異常［33］。晝夜節律和分子鐘機制調節骨骼肌大量基因的表達，其中許多基因還參與轉錄、肌發生分化和新陳代謝［29］，晝夜節律紊亂可能會損害骨骼肌的健康。正常情況下，骨骼肌和其他組織協同工作，保持一致的晝夜節律。缺失核心鐘基因BMAL1導致肌組織嚴重病變，如肌纖維型轉變、肌節結構異常等［14］。肌節是骨骼肌的基本結構和功能單位，位于相鄰兩條Z線之間的一段肌原纖維，其中Z線是由多種蛋白組成的復雜結構［34］。已知Z線相關蛋白Tcap（Titin cap，telethonin）參與調節正常肌節的發育。Tcap能夠與Titin N末端結構域結合，作為Titin激酶的底物，與Titin相互作用保證肌節的完整性［34］。胚胎發育過程中，肌調節因子MyoD、myo?genin和Mfy5能夠結合到Tcap啟動子區域的E?box，控制Tcap的表達，影響骨骼肌肌節的結構及完整性［35］。骨骼肌成肌細胞C2C12分化過程中Tcap的表達顯著上調，并呈明顯的周期性節律，通過RNA干擾（RNA interference）敲低Tcap則抑制C2C12的分化及生長［36］。BMAL1/CLOCK二聚體能夠促進Tcap表達，BMAL1/CLOCK二聚體結合MyoD啟動子協同增強促進Tcap的表達。胚胎發育過程中Myogenin也參與調節Z線組成蛋白［37］，促進Tcap表達。綜上，研究骨骼肌晝夜節律分子鐘機制將有助于明確分子鐘基因在骨骼肌發育分化過程中的作用及對骨骼肌功能和代謝的影響，為維持骨骼肌的健康提供新思路，對研究因為晝夜節律紊亂引發的疾病也有一定的指導意義。

［1］LOUDON A S.Circadian biology：a 2.5 billion year old clock［J］.Curr Biol，2012，22（14）：R570?R571.

［2］DOLASTSHAD H，CARY A J，DAVIS F C，et al.Differential expression of the circadian clock in maternal and embryonic tis?sues of mice［J］.PLos One，2010，5（3）：e9855.

［3］MISTLBERGER R E.Circadian regulation of sleep in mammals：role of the suprachiasmatic nucleus［J］.Brain Res Brain Res Rev，2005，49（3）：429?454.

［4］MAYEUF?LOUCHART A，STAELS B，DUEZ H.Skeletal mus?cle functions around the clock［J］.Diabetes Obes Metab，2015，17 Suppl 1：39?46.

［5］DAVIDSON A J，YAMAZAKI S，ARBLE D M，et al.Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats［J］.Neurobiol Aging，2008，29（3）：471?477.

［6］CHATTERJEE S，NAM D，GUO B，et al.Brain and muscle Arnt?like 1 is a key regulator of myogenesis［J］.J Cell Sci，2013，126（Pt 10）：2213?2224.

［7］RIPPERGER J A，JUD C，ALBRECHT U.The daily rhythm of mice［J］.FEBS Lett，2011，585（10）：1384?1392.

［8］YOO S H，YAMAZAKI S，LOWREY P L，et al.PERIOD2：：LUCIFERASE real?time reportingof circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues［J］.Proc Natl Acad Sci U S A ，2004，101（15）：5339?5346.

［9］BROWN S A.Circadian clock?mediated control of stem cell divi?sion and differentiation：beyond night and day［J］.Develop?ment，2014，141（16）：3105?3111.

［10］MILLER B H，MCDEARMON E L，PANDA S，et al.Circadian and CLOCK?controlled regulation of the mouse transcriptome and cell proliferation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（9）：3342?3347.

［11］BUHR E D，TAKAHASHI J S.Molecular components of the mammalian circadian clock［J］.Handb Exp Pharmacol，2013，（217）：3?27.

［12］SOLT L A，WANG Y，BANERJEE S，et al.Regulation of circa?dian behaviour and metabolism by synthetic REV?ERB agonists［J］.Nature，2012，485（7396）：62?68.

［13］RAO R T，PIERRE K K，SCHLESINGER N，et al.The poten?tial of circadian realignment in rheumatoid arthritis［J］.Crit Rev Biomed Eng，2016，44（3）：177?191.

［14］HARFMANN B D，SCHRODER E A，ESSER K A.Circadian rhythms，the molecular clock，and skeletal muscle［J］.J Biol Rhythms，2015，30（2）：84?94.

［15］FENG D，LIU T，SUN Z，et al.A circadian rhythm orchestrated by histone deacetylase 3 controls hepatic lipid metabolism［J］.Science，2011，331（6022）：1315?1319.

［16］ROBINSON I，REDDY A B.Molecular mechanisms of the circa?dian clockwork in mammals［J］.FEBS Lett，2014，588（15）：2477?2483.

［17］VALDEZ M R，RICHARDSON J A，KLEIN W H，et al.Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin，MyoD，and MRF4［J］.Dev Biol，2000，219（2）：287?298.

［18］KASSAR?DUCHOSSOY L，GAYRAUD?MOREL B，GOMèS D，et al.Mrf4 determines skeletal muscle identity in Myf5：Myod double?mutant mice［J］.Nature，2004，431（7007）：466?471.

［19］SHAVLAKADZE T，ANWARI T，SOFFE Z，et al.Impact of fasting on the rhythmic expression of myogenic and metabolic fac?tors in skeletal muscle of adult mice［J］.Am J Physiol Cell Physi?ol，2013，305（1）：C26?C35.

［20］DACWAG C S，BEDFORD M T，SIF S，et al.Distinct protein arginine methyltransferases promote ATP?dependent chromatin remodeling function at different stages of skeletal muscle differ?entiation［J］.Mol Cell Biol，2009，29（7）：1909?1921.

［21］YAMANAKA S，BLAU H M.Nuclear reprogramming to a plurip?otent state by three approaches［J］.Nature，2010，465（7299）：704?712.

［22］WASHABAUGH C H，ONTELL M P，SHAND S H，et al.Neu?ronal control of myogenic regulatory factor accumulation in fetal muscle［J］.Dev Dyn，2007，236（3）：732?745.

［23］MEADOWS E，CHO J H，FLYNN J M，et al.Myogenin regu?lates a distinct genetic program in adult muscle stem cells［J］.Dev Biol，2008，322（2）：406?414.

［24］HIGASHIOKA K，KOIZUMI N，SAKURAI H，et al.Myogenic differentiation from MYOGENIN?mutated human iPS cells by CRISPR/Cas9［J］.Stem Cells Int，2017，2017：9210494.

［25］YAN Z，OKUTSU M，AKHTAR Y N，et al.Regulation of exer?cise?induced fber type transformation，mitochondrial biogene?sis，and angiogenesis in skeletal muscle［J］.J Appl Physiol（1985），2011，110（1）：264?274.

［26］ANDREWSA J L，ZHANG X，MCCARTHY J J，et al.CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（44）：19090?19095.

［27］SCHRODER E A，HARFMANN B D，ZHANG X，et al.Intrin?sic muscle clock is necessary for muscle of skeletal health［J］.J Physiol，2015，593（24）：5387?5404.

［28］WOLDT E，SEBTI Y，SOLT L A，et al.Rev?erb?α modulates skeletal muscle oxidative capacity by regulating mitochondrial biogenesis and autophagy［J］.Nat Med，2013，19（8）：1039?1046.

［29］MCCARTHY J J，ANDREWS J L，MCDEARMON E L，et al.Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skele?tal muscle［J］.Physiol Genomics，2007，31（1）：86?95.

［30］RUDNICKI M A，BRAUN T，HINUMA S，et al.Inactivation of MyoD in mice leads to up?regulation of the myogenic HLH gene Myf?5 and results in apparently normal muscle development［J］.Cell，1992，71（3）：383?390.

［31］MARTIN A M，ELLIOTT J A，DUFFY P，et al.Circadian regu?lation of locomotor activity and skeletal muscle gene expression in the horse［J］.J Appl Physiol（1985），2010，109（5）：1328?1336.

［32］VINCENT S D，MAYEUF A，NIRO C，et al.Non conservation of function for the evolutionarily conserved prdm1 protein in the control of the slow twitch myogenic program in the mouse embryo［J］.Mol Biol Evol，2012，29（10）：3181?3191.

［33］REAVEN G M.Insulin resistance，the insulin resistance syn?drome，and cardiovascular disease［J］.Panminerva Med，2005，47（4）：201?210.

［34］VALLE G，FAULKNER G，DE ANTONI A，et al.Telethonin，a novel sarcomeric protein of heart and skeletal muscle［J］.Febs Lett，1997，415（2）：163?168.

［35］CLARK K A，MCELHINNY A S，BECKERLE M C，et al.Stri?ated muscle cytoarchitecture：an intricate web of form and func?tion［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2002，18：637?706.

［36］MARKERT C D，NING J，STALEY J T，et al.TCAP knock?down by RNA interference inhibits myoblast differentiation in cultured skeletal muscle cells［J］.Neuromuscul Disord，2008，18（5）：413?422.

［37］JI Z X，DU C，WU G S，et al.Synergistic up?regulation of mus?cle LIM protein expression in C2C12 and NIH3T3 cells by myo?genin and MEF2C［J］.Mol Genet Genomics，2009，281（1）：1?10.