硬組織切片VG染色不良原因分析及對策

(西安空軍軍醫大學西京醫院全軍骨科研究所 陜西 西安710032)

1 切片有黑色、藍色雜質

1.1 分析[1](1)組織塊取材時過大、過厚導致組織塊內部固定液難以徹底沖洗干凈；透明液滲透難、滲透慢、透明不徹底，造成黑色雜質，延長制片時間 。(2)載玻片沒有擦洗干凈，或被其他雜質污染，造成黑色雜質。(3)亞甲基藍沒有充分加熱溶解，所殘余的沉淀物導致有藍色雜質(圖 1)。

圖1 左邊黑色為金屬材料，右邊黑色顆粒為雜質，無形態結構的藍色小點是亞甲基藍沒有充分加熱溶解，殘留的雜質。

1.2 應對[1](1)確定好要切片的方向，將組織用骨組織快速切割機(西安瑞豐儀器設備有限公司)鋸成長2厘米的骨塊，厚度盡量控制在1cm左右，以便液體容易滲透，縮短制片時間。流水沖洗時間由原來的30分鐘延遲至1小時，將組織塊內部的固定液徹底沖洗干凈。(2)粘片用的樹脂載玻片一定擦洗干凈。(3)亞甲基藍提前30分鐘放入60℃水浴鍋水浴，確保染液充分加熱溶解再進行染色。

2 切片有氣泡、空洞；切片邊緣翹起，切片易折斷

2.1分析(1)包埋過程中，組織塊凝固時水浴鍋提前打開加熱，水浴鍋溫度調的過高，引起包埋液凝固過快、過猛，產生大量氣泡。 (2)組織塊在塑料液里浸泡時間過短，塑料液沒有充分滲透到組織內部，切出的片子產生空洞。(3)粘片時502膠用量太多或太少，太多膠會溢出，太少切片不能完全粘住，邊緣容易翹起，切片易折斷。氣泡的出現與粘片技巧也息息相關[2](圖 2)。

圖2 包埋和粘片過程中產生的氣泡

2.2 應對(1)包埋用的甲基丙烯酸甲脂的聚合分為引發、發展、終止三個階段，分子結構含有雙鍵，產生活化中心，即游離基，這是引發階段。單體活化中心進一步激發其他單體，產生新的活化中心，出現聚合反應，放出大量聚合熱，此為發展階段。最后失去活化中心而終止[3]。根據我們實驗室多年來的經驗，凝固過程中，先將帶有包埋劑的組織塊放入水浴鍋，再打開水浴鍋電源，逐漸升溫，嚴格控制水浴溫度，溫度太低凝固過慢，太高會產生大量氣泡，一般控制在45℃。水浴24小時組織塊可完全凝固。(2)粘片時502膠的用量要適當，太少粘不牢，太多膠會溢出，一般小組織輕輕擠一小滴，大組織用力擠一大滴就可以，以剛好鋪滿片子為宜。用彎頭小聶反復擠壓幾次，以擠出殘留的氣泡。(3)根據組織塊大小決定浸泡塑料液的時間，硬組織切片需要分別浸泡塑料液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，一般每瓶液各泡3～5天，根據組織塊大小決定浸泡塑料液的時間。讓塑料液充分滲透到組織塊內部，就不會出現空洞現象。

3 膠原纖維、類骨質，肌纖維形態結構不清楚；骨小梁顏色過深，成黑紅色；顏色深淺不一。

3.1 分析(1)亞甲基藍染色時間過長，導致顏色過深，甚至顏色發黑，膠原纖維、類骨質，肌纖維形態結構不清楚。(2)20%甲醇浸泡時間過長，骨小梁顏色由鮮亮的紅色變成黑紅色。(3)片子薄厚不均導致顏色深淺不一(圖 3)。

圖 3 亞甲基蘭染色5分鐘，軟組織呈黑色，形態結構無法觀察

3.2 應對(1)亞甲基藍染色時間由原來五分鐘縮短到三分鐘(2)20%甲醇浸泡控制在2小時。(3) 磨片時掌握好力度，力求磨出的片子薄厚均勻。

4 切片有縱橫交錯的黑色細紋

4.1 分析 縱橫交錯的黑色細紋是用砂子磨片后拋光不徹底殘留的劃痕,影響圖片美觀(圖 4)

圖4 磨片后拋光不徹底，有劃痕

4.2 應對(1)經我們實驗室反復實驗，選用TA805型齒科打磨拋光機，康齒寧牙齒拋光膏代替原來用三氯化鋁拋光粉的手動拋光。拋光速度快、效果好，大大提高了效率。具體方法： 適量的康齒寧拋光膏和自來水混合，攪拌均勻，將切片在混合液里沾一下，雙手扶穩切片，在拋光機上拋光，橫向縱向重復此動作6～7次。(2)拋光后的切片需在顯微鏡下檢查，仍有劃痕，繼續拋光，直至無劃痕為止。

5 結果

切片的制作是一個連續的過錯，環環相扣，每個環節都不能馬虎，一個環節出現問題直接影響切片染色效果，通過以上各個環節的改進，大大提高了染色效果。切片完整、顏色鮮亮、 對比度明顯、無雜質、無氣泡、無空洞、無劃痕(圖 5)。

圖5 經改進后的VG染色效果圖

[1]范小莉，胥維勇，楊群，等. 陳思燏HE 染色不良的分析與應對方法[J]. 臨床與實驗病理學雜志, Clin Exp Pathol 2014 Jul; 30( 7).

[2]馬恒輝, 周曉軍. HE染色常見問題與對策[J]. 臨床與實驗病理學雜志,ClinExpPathol 2008 Aug;24(4).

[3]孟國林，呂榮，劉建，等． 骨科實驗技術[M]． 北京:人民衛生出版社，2012，1(3):41．