丹參多酚酸鹽對老年冠心病患者高密度脂蛋白功能的影響

張 濤 王旭蘭 李秀紅 李向陽 從國彬

(商丘醫學高等專科學校，河南 商丘 476000)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CAHD)患者發病率和致死率極高，老年CAHD患者冠狀動脈血管鈣化嚴重，冠脈介入手術難度大，且大多數老年患者對手術持排斥態度，更希望藥物保守治療〔1～6〕。高密度脂蛋白(HDL)因其可逆向轉運膽固醇而稱作“血管清道夫”，HDL的血漿含量與心血管事件的發生呈負相關〔7,8〕。然而，大量關于提升血漿HDL含量的臨床研究發現，HDL含量的單純提升并沒有減少相關心血管發生率，進而使研究者更加注重HDL功能學的改變〔9～14〕。丹參多酚因其具有活血、化瘀、通脈作用而被廣泛應用于臨床CAHD穩定性心絞痛患者，丹參多酚酸鹽是否會影響HDL功能尚無報道。本研究擬闡明丹參多酚酸鹽發揮心血管保護作用的分子生物學機制。

1 資料與方法

1.1研究對象 實驗組為2016年3～12月就診于陜西中醫藥大學附屬醫院心內科CAHD患者50例，年齡62～85歲，排除患有高血壓、糖尿病、腎衰竭、嚴重感染性疾病等疾病的患者。對照組選取來陜西中醫藥大學附屬醫院健康體檢的老年志愿者30例，年齡60～ 72歲。本研究已通過陜西中醫藥大學倫理委員會審核，參與者均簽署知情同意書。兩組一般資料見表1。

1.2HDL提取 抽取對照組及實驗組〔入院當天及應用丹參多酚酸鹽200 mg(上海綠谷制藥有限公司50 mg/支)7 d后〕空腹靜脈血，參考文獻〔15〕，通過速梯度離心提取HDL：空腹靜脈血離心(4℃ 4 000 r/min 10 min)后將血漿移入預冷的超高速管(38 ml，Beckman coulter公司)并按比例加入1∶500的乙二胺四乙酸(EDTA，134 mmol/L)和1∶10 000的二丁基羥基甲苯(BHT，200 mmol/L)后離心3次(4℃ 50 000 r/min 21 h)。每次離心結束后，血漿因其各個成分密度差異而分層，用無菌注射器小心吸取HDL并用0.22 μm的濾器(MerkMillipore公司)過濾后用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(BCA Protein Assay Kit，Thermo Scientific 公司)測定其濃度，提取完畢的HDL存放于4℃冰箱備用(可有效儲存3 w)。

1.3HDL抗氧化能力檢測 按照文獻〔16〕報道cell-free法檢測抗氧化能力。將配置好的 CuCl2(21.7 μmol/L，Sigma公司)10 μl加入同等質量的實驗組和對照組HDL內避光孵育，孵育至30 min時取10 μl配置好的〔雙氯熒光黃乙酸乙酯(DCFH-DA)，Calbiochem公司，2.0 mg/ml〕加入正在孵育CuCl2的HDL內繼續孵育30 min，孵育滿1 h后用酶標儀(Spectra Max，Gemini XS；Molecular Devices，美國Molecular Devices)連續檢測12 h讀取相對熒光強度值(RFU)記錄分析(理論上RFU值越高，抗氧化能力越弱)。

表1 對照組和實驗組一般臨床資料

與對照組比較：1)P<0.05

1.4HDL對內皮細胞一氧化氮(NO)含量的影響 取4代人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)種植于24孔板內至細胞鋪滿>95%后進行實驗干預，實驗分為5組：空白組不做任何處理；陽性對照組加入血管內皮生長因子(VEGF)50 ng/ml，對照組加入正常志愿者的HDL 100 μg/ml；實驗組加入CAHD患者的HDL 100 μg/ml，丹參多酚組加入用丹參多酚酸鹽1 w后的HDL 100 μg/ml。孵育30 min后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入二氨基苯甲酸乙酯(DAF-2DA，10 μmol/L，Calbiochem)再次孵育30 min后使用熒光顯微鏡拍照(激發波長495 nm，發射515 nm)并記錄。

1.5HDL對內皮細胞內源性NO合酶(eNOS)及其磷酸化位點Ser1177的影響 取4代HUVECs種植于6孔板內至細胞鋪滿>95%后進行實驗干預，實驗分為3組：空白組不做任何處理；對照組加入正常志愿者的HDL 100 μg/ml；實驗組加入CAHD患者的HDL 100 μg/ml。孵育1 h后提取內皮細胞蛋白，通過Western印跡法檢測各組HDL對eNOS蛋白及其磷酸化位點Ser1177影響的差異。

1.6統計學方法 用Graph pad prism5作圖，采用SPSS11.0軟件進行t檢驗及F分析。

2 結 果

2.1實驗組、對照組和丹參多酚組HDL抗氧化能力 與對照組HDL(RFU值為380.2±51.66)比較，實驗組HDL抗氧化能力明顯減弱(RFU值為1 000.12±100.65，P<0.05)，丹參多酚組(RFU值為752.64±60.74)與對照組、實驗組差異有統計學意義(P<0.05)。

2.25組HDL對內皮細胞NO含量影響 與空白組比較，陽性對照組和對照組明顯促進內皮細胞生成NO，實驗組促進內皮細胞生成NO的能力明顯減弱，丹參多酚組一定程度改善HDL生成NO的能力。見圖1。

圖1 各組HDL對內皮細胞生成NO的影響(×40)

2.3各組HDL對內皮細胞eNOS蛋白活化的影響 與空白組比較，對照組HDL刺激內皮細胞中eNOS蛋白的活化；實驗組HDL抑制內皮細胞中eNOS蛋白的活化。丹參多酚酸鹽的應用可以部分恢復內皮細胞中eNOS蛋白的活化。見圖2和表2。

圖2 各組HDL對內皮細胞eNOS蛋白表達變化的影響

表2 各組HDL對內皮細胞eNOS蛋白活化的比較

1)與空白組比較；2)與對照組比較；3)與實驗組比較：均P<0.05

3 討 論

本研究結果闡明了丹參多酚酸鹽在老年CAHD患者中發揮心血管保護功的分子生物學機制。CAHD所致心肌缺血有高致死性，尤其在老年患者中，因其冠狀動脈血管鈣化嚴重，且老年患者機體各個器官均處于終末期，其危險性不言而喻。然而目前臨床上仍缺乏有效改善心肌缺血的方法。血管舒張功能受損被認為是冠心病的早期變化，而研究發現NO和eNOS在此過程中發揮了重要作用〔5〕。既往研究〔17〕表明：正常人的HDL通過活化eNOS信號通路，進而釋放NO而促進血管舒張。研究發現〔18，19〕：正常人的HDL通過 PI3K/Akt和與細胞增殖緊密相關的蛋白激酶(RAS)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路參與血管新生。研究顯示疾病狀態下的HDL無論是結構還是功能上與正常HDL均存在差異：CAHD患者HDL抗氧化能力減弱〔20〕；CAHD患者HDL喪失了活化Akt/eNOS等信號通路的能力〔21〕。李紅文等〔22〕研究顯示：CAHD患者HDL促進內皮細胞增殖、遷移的能力明顯減弱。

研究發現〔23〕：丹參多酚可以降低人為冠狀動脈結扎導致的犬急性心肌梗死的心電圖ST段抬高程度、減少心肌梗死的面積、降低血清中低密度脂蛋白含量、部分抑制二磷酸腺苷(ADP)誘導的大鼠血小板聚集作用。本文結果說明丹參多酚酸鹽可以部分修復CAHD患者HDL的心血管保護作用。

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