老年耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐藥機制及院內高毒力莢膜基因型分布特點

馮曉靜 劉 娟 段少華 朱 靜 王曉利

(承德市中心醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，河北 承德 067000)

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌多見于醫(yī)院獲得性感染，老年人因免疫力下降屬于易感人群，治療預后很差〔1〕。該領域研究者已報道，在無肝膽病史患者中發(fā)現了肺炎克雷伯菌性肝膿腫，并發(fā)生轉移感染，因該類菌株的生物學特性和致病能力與普通肺炎克雷伯菌存在差異，因此定義為高毒力肺炎克雷伯菌〔2〕。肺炎克雷伯菌毒力增強與莢膜多糖、毒力基因有關，包含78種以上的莢膜血清型，毒力最強的為K1、K2，是毒力決定元素〔3〕。目前對多重耐藥的高毒力肺炎克雷伯菌研究較少，特別是耐碳青霉烯的高毒力肺炎克雷伯菌。相關研究顯示，碳青霉烯酶Kpc基因轉入K2莢膜型肺炎克雷伯菌后對碳青霉烯類藥物耐藥〔4〕。本研究旨在探討老年患者中分離的18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐藥機制和毒力基因情況。

1 材料與方法

1.1材料 收集2016年1月至2017年3月承德市中心醫(yī)院收治的老年患者中分離出的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌18株，剔除同一患者相同部位的重復樣本，男11例，女7例；樣本類型：痰液8份，血液、尿液、導管各2份，膽汁、咽拭子、肺泡灌洗液、傷口分泌物各1份。

1.2菌株鑒定和藥敏試驗 常規(guī)行細菌接種培養(yǎng)純化后，使用Phoenix 100全自動微生物鑒定儀對菌株進行鑒定；采用K-B法檢測美羅培南、頭孢哌酮-舒巴坦藥敏，MTS法測定替加環(huán)素藥敏，碳青霉烯藥敏采用亞胺培南紙片復篩。

1.3碳青霉烯酶表型試驗 (1)改良Hodge試驗：配置大腸埃希氏菌NCTC12900懸液，培養(yǎng)液10倍稀釋后接種到M-H瓊脂平皿，干燥后加入美羅培南紙片，取4～5個待測菌落接種到紙片邊緣，35℃孵育18～20 h后觀察。(2)EDTA協(xié)同試驗：將待測菌懸液涂于M-H平皿上，干燥后貼亞胺培南紙片，取其中一張滴加20 μl 1.0 mmol/L的乙二胺四乙酸溶液，第二張不滴加任何試劑，在35℃環(huán)境中靜置22～24 h，測量紙片間的抑菌環(huán)差值，>5 mm為陽性。(3)Carba NP試驗：依據2016年美國臨床與實驗室標準化協(xié)會制定的藥敏試驗標準，檢測產碳青霉烯酶情況，并進行分類。

1.4毒力表型試驗 (1)拉絲試驗：待測菌株接種到血清瓊脂平板，在27℃環(huán)境中靜置24 h后，用接種環(huán)挑取菌種在培養(yǎng)基上劃線，當黏液絲長度≥5 mm為陽性。(2)生物被膜形成試驗：調整肺炎克雷伯菌濃度為1×106CFU/ml，96孔板中每孔分別加入100 μl菌液，常規(guī)孵育24 h，每孔加入30 μl結晶紫，混勻后孵育20 min，洗滌后上酶標儀讀取590 nm處吸光度，OD值>0.5為高產生物被膜，0.1～0.5為中產生物被膜，<0.1為低產生物被膜。(3)血清殺傷敏感性試驗：吸取1×106CFU/ml 30 μl菌液加入80 μl健康體檢者2 ml血清中，分別于0、60、120、180 min移去一半細菌懸液，MH肉湯稀釋10倍，20 μl接種到MH平板，孵育20～24 h后判讀結果。

1.5耐藥基因、高毒力莢膜血清型及基因檢測 PCR檢測耐藥基因分布情況，包括碳青霉烯基因(Kpc、Imp、Vim等)、超廣譜β-內酰胺酶基因(Tem、Shv、Ctx-M)、AmpC酶基因(DHA)，膜孔蛋白編碼基因(Ompk35、36)。高毒力莢膜血清型(K1、K2、K5等)；毒力基因(rmpA、Acrobactin、FimH-1)。操作步驟：煮沸法制備菌株DNA模板，PCR引物序列由北京天恩澤生物技術有限公司生產。反應體系20 μl：dNTP 2 μl、Taq DNA聚合酶3 μl、10×Buffer 3 μl、上下游引物各1 μl、cDNA 1 μl、雙蒸餾水9 μl。反應條件：94℃ 2 min、94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 45 s，共40個循環(huán)。擴增產物電泳后分析各條帶。

1.6統(tǒng)計學分析 使用SPSS19.0軟件行χ2檢驗。

2 結 果

2.1碳青霉烯酶表型試驗結果 18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌中改良Hodge試驗陽性9株，弱陽性1株，見圖1A；EDTA協(xié)同試驗陽性10株，見圖1B；18株Carba NP試驗均為產酶菌，A類酶10株，同時產A類、B類或D類酶8株。

2.2耐藥基因和膜孔蛋白檢測結果 Kpc、Ndm、Tem、Shv、Ctx-M、Dha基因在相應的位置均出現條帶，但Imp、Sim、Vim、Oxa-48基因未出現條帶。18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶檢出Kpc基因6株(33.33%)，Ndm基因7株(38.89%)；超廣譜β-內酰胺酶中Shv檢出15株(83.33%)，明顯高于Ctx-M基因10株(55.56%)、Tem基因7株(38.89%)(P<0.01)；AmpC酶中檢出DHA基因2株(11.11%)；見圖2。膜孔蛋白基因PCR電泳顯示，Ompk35編碼基因缺失7株(38.89%)，Ompk36缺失10株(55.56%)，Ompk36編碼基因缺失率明顯高于Ompk35(P<0.05)；且當Ompk35基因缺失時Ompk36也缺失；見圖3。

A:M-H平皿中心為美羅培南紙片，1為肺炎克雷伯菌陽性對照，2為陰性對照，3為該院內分離得到的產碳青霉烯肺炎克雷伯菌，4為碳青霉烯酶陰性肺炎克雷伯菌；B:M-H平皿上的兩張亞胺培南紙片圖1 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型試驗

圖2 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐藥基因PCR電泳圖

圖3 膜孔蛋白編碼基因PCR電泳圖

2.3毒力表型試驗結果 拉絲試驗顯示，18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌中陽性2株；生物被膜形成試驗顯示，高、中、低產生物被膜分別檢出6株、5株、7株；血清殺傷敏感性試驗顯示，抵抗、中介敏感、高敏感分別為5株、5株、8株。

2.4高毒力莢膜血清型及毒力基因檢出情況 18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌進行莢膜分型顯示，K1型4株，K57型2株，未檢出K2、5、20及54，未分型12株。rmpA陽性7株(38.89%)、Acrobactin陽性4株(22.22%)、二者同時陽性7株(38.89%)，rmpA陽性率明顯高于Acrobactin(P<0.05)；4株K1型肺炎克雷伯菌均攜帶rmpA基因，其中1株同時攜帶Acrobactin基因；2株K57型肺炎克雷伯菌均攜帶rmpA基因；18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌均攜帶FimH-1基因。見圖4。

圖4 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌高毒力莢膜血清型及毒力基因PCR電泳圖

2.5毒力表型試驗與高毒力莢膜血清型及毒力基因的關系 拉絲試驗呈陽性的2株均未檢出高毒力莢膜血清型，K1和K57型的6株拉絲試驗為陰性。4株K1型中1株血清殺傷作用抵抗，高產生物被膜；3株血清殺傷作用高敏感，低產生物被膜。2株K57型均對血清殺傷作用中間抵抗，中產生生物被膜。

2.6耐藥基因與高毒力莢膜血清型及毒力基因的關系 7株攜帶rmpA基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌株均產碳青霉烯酶，其中4株產Kpc、2株產Ndm，1株同時產Kpc和Ndm，均合并膜孔蛋白變異。4株攜帶Acrobactin基因的菌株中3株產碳青霉烯酶，其中2株產Kpc、1株產Ndm，均合并膜孔蛋白變異。

3 討 論

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院及社區(qū)獲得性感染的重要條件致病菌，機體免疫力下降的老年人群常可引發(fā)呼吸道、泌尿道感染，甚至導致敗血癥。碳青霉烯類抗菌藥物是目前臨床治療肺炎克雷伯菌的一線藥物，但近年來耐藥性逐漸增加，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的治療預后很差，特別是老年患者。研究發(fā)現碳青霉烯類耐藥機制可能包括攜帶多種碳青霉烯酶，分泌超廣譜β-內酰胺酶或AmpC酶合并外膜孔蛋白變異，藥物作用靶位點改變〔5〕。Kpc基因是我國近年來流行的碳青霉烯酶，Ndm基因自發(fā)現起已在全球范圍內廣泛傳播〔6〕。本次研究18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌株中均產碳青霉烯，提示碳青霉烯酶是承德市中心醫(yī)院老年患者中肺炎克雷伯菌耐藥的主要因素之一。

肺炎克雷伯菌分泌超廣譜β-內酰胺酶或AmpC酶合并膜孔蛋白編碼基因變異時，會引發(fā)厄他培南耐藥，提升亞胺培南的MIC值〔7〕。本次研究中發(fā)現超廣譜β-內酰胺酶或合并膜孔蛋白變異的菌株出現耐藥，還發(fā)現Ompk36在肺炎克雷伯菌株對碳青霉烯耐藥中發(fā)揮重要作用。相關研究發(fā)現，K1、K2、K5莢膜型以及rmpA、Acrobactin等毒力相關基因表達水平與肺炎克雷伯菌毒力存在明顯關聯〔8〕。本次研究中成功分離出4株K1型菌株，分離率較高，且均攜帶rmpA基因，1株同時攜帶Acrobactin基因。此外還檢出2株菌株，均攜帶rmpA基因。rmpA基因可調控莢膜合成，Acrobactin基因是肺炎克雷伯菌中主要鐵載體細胞，上述兩種基因是除莢膜型之外毒力最常見的決定元素。研究者已從耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌株中檢出產Kpc基因的高毒力莢膜血清型菌株〔9〕。本次研究從18株菌株中檢出產Kpc基因6株，高毒力莢膜型菌株4株；相關研究顯示，K1-Hvkp可獲得攜帶Kpc基因的質粒，產生高耐藥、高毒力的菌株〔10〕。結合本實驗結果可推測高毒力菌株與碳青霉烯類耐藥存在關聯。

1楊雪妹，吳允孚.碳青霉烯類抗生素對重癥監(jiān)護病房老年患者耐藥菌的體外抑菌效果〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(5)：1225-7.

2齊 艷.產KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌分子分型及傳播機制研究〔D〕.杭州：浙江大學，2012.

3曹在秋.CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶在肺炎克雷伯菌中的分子進化機制研究〔D〕.鄭州：鄭州大學，2016.

4李詠梅，高麗娜，張 艷.產CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌耐藥性分析〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2012；13(3)：291-5.

5蘇桂新，王怡楊，王 強.多重耐藥HvKP菌株臨床感染分布及耐藥機制〔J〕.中國老年學雜志，2017；37(12)：3048-50.

6龍翔玲，吳林燕.EICU高血壓腦出血并發(fā)肺部感染的相關因素和集束化干預效果〔J〕.中國衛(wèi)生工程學，2017；16(3)：360-1.

7鄧 瓊.醫(yī)院感染血液中肺炎克雷伯菌的分子流行病學及其耐碳青霉烯類抗菌藥物危險因素調查〔D〕.南昌：南昌大學，2014.

8劉曉薇，孫 賀，李詠梅.腸球菌臨床耐藥性分析及耐藥基因vanM在屎腸球菌中的檢測〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2014；15(4)：482-5.

9李 航，羅俊華，毛向明.泌尿道結石合并感染患者尿液標本中病原菌分布及耐藥性分析〔J〕.中國衛(wèi)生工程學，2017；16(2)：245-6.

10楊繼勇.產KPC肺炎克雷伯菌分子流行病學與分子特征研究〔D〕.北京：中國人民解放軍醫(yī)學院，2013.