雄激素受體基因?qū)η傲邢侔┮浦擦錾L及PI3K/AKT信號通路的影響

徐 猛 劉佳杰 王海光 劉寶豪 虢中強 姜華茂

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧 錦州 121000)

前列腺癌的發(fā)展和惡化與雄激素和雄激素受體(AR)信號調(diào)控密切相關(guān)〔1〕。雄激素在體內(nèi)激活具有轉(zhuǎn)錄因子活性的AR，使其調(diào)控下游各基因表達，從而影響前列腺癌的發(fā)展。通過手術(shù)或化學(xué)藥物實行雄激素剝奪療法是目前治療晚期前列腺癌的標準治療方法，雖然該方法初始階段具有明顯抑制前列腺癌的效果，但經(jīng)過1～2年的治療后幾乎所有患者對雄激素剝奪療法不再敏感，這可能與AR基因突變、AR基因擴增和超表達等有關(guān)〔2〕。磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)機體細胞生長、增殖、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)和趨化等多種病理生理學(xué)過程，是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一〔3〕。目前關(guān)于前列腺癌生長侵襲和轉(zhuǎn)移中PI3K/AKT信號通路是否發(fā)揮重要作用及機制鮮有報道。本研究以小片段發(fā)夾 RNA(shRNA)介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)下調(diào)AR的表達，以探討AR基因表達對BALB/C裸鼠移植瘤生長及PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達的影響。

1 資料與方法

1.1實驗動物及腫瘤細胞株 健康清潔級BALB/C雄性裸鼠35只，體重18～22 g，4～5周齡，購于上海動物實驗中心。動物購置后在正式實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(23±2)℃，12 h/12 h 晝夜燈光干預(yù)，自由飲水、進食。人前列腺癌細胞株DU-145，購于中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2主要試劑和儀器 pRNA.U6.1/Neo質(zhì)粒、RPMI-1640培養(yǎng)基、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(美國Sigma公司)；胰蛋白酶、胎牛血清(美國Invitrogen Gibco公司)；Bam HI內(nèi)切酶、HindⅢ內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶、iMark酶標儀(美國Bio-Rad)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(大連TaKaRa 公司)；PCR試劑盒、ABI 7500 RT-PCR 儀(美國ABI公司)；Amersham ECL Prime 蛋白印跡試劑(美國GE Healthcare公司)；BCA蛋白定量試劑盒(購自美國Pierce公司)；AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、mTOR和p-mTOR抗體(美國Cell Signaling Technology)；細胞裂解液、β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗大鼠IgG(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Western印跡電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，F(xiàn)luor Chem Q蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)(美國Nature Gene Corp公司)。AR mRNA引物(上游：5'-AAG CCT ATG AAT GTC AGC CCA -3'，下游：5'-CAT TGA GGC TAG AGA GCA AG CC-3')，內(nèi)參基因GAPDH引物(上游：5'-AGG TCC ACC ACT GAC ACG TT-3'，下游：5'-GCC TCA AGA TCA TCA GCA AT-3')，購自上海生工。

1.3構(gòu)建AR shRNA及制備重組質(zhì)粒 根據(jù)Gen-Bank公布的人AR基因序列合成寡核苷酸鏈：①5'-GAT CCT ATC CCA GTC CCA CTF GAT CGA GCA AGT GGG ACT GGG ATA GGG CTT TTT-3'；②5'-AGC TAA AAA GCC CTA TCC CAG TCC CAC TTG CTC GAT CAA GTG GGA CTG GGA TAG-3'。將此2條互補單鏈加入超純水稀釋至100 pmol/L，等量混合后加熱至100℃煮沸10 min，自然冷卻后即形成雙鏈DNA片段，酶切pRNA-U6.1/Neo質(zhì)粒形成線性質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶將線性質(zhì)粒和雙鏈DNA片段連接成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，培養(yǎng)24 h，經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒提取AR shRNA質(zhì)粒。

1.4移植瘤裸鼠模型制備 培養(yǎng)前列腺癌細胞株DU-145至細胞長滿90%培養(yǎng)皿時消化后按1∶3傳代。制備2×107/ml細胞懸液，5只BALB/C裸鼠后肢腹側(cè)分別注入0.5 ml/只，2 w后處死已形成皮下腫瘤的BALB/C裸鼠，無菌取出皮下腫瘤組織，用生理鹽水研磨并調(diào)制細胞懸液濃度為2×107/ml。將30只BALB/C裸鼠后下肢皮下接種0.2 ml細胞懸液制造前列腺癌裸鼠模型。

1.5分組和給藥 將30只前列腺癌裸鼠模型隨機分為3組，每組10只，分別為模型對照組、陽性對照組和實驗組。陽性對照組裸鼠每天尾靜脈注射氟尿嘧啶20 mg/kg，實驗組和模型對照組裸鼠分別尾靜脈注射AR shRNA質(zhì)粒2 mg/kg或同體積生理鹽水，各組裸鼠于造模后當(dāng)天開始連續(xù)給藥10 d，實驗4 w后結(jié)束。

1.6前列腺癌移植瘤體積測量 用游標卡尺測量各組裸鼠給藥后第3 日、第1周、第2周、第3周和第4周時移植瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積(V=0.52×長徑×短徑2)，比較各組BALB/C裸鼠腫瘤生長情況。

1.7前列腺癌移植瘤AR mRNA表達水平測定 實驗結(jié)束時處死裸鼠后剝離種植瘤后置液氮保存。取各組裸鼠瘤組織用Trizol液常規(guī)提取各組細胞RNA，使用iMark酶標儀測定260 nm和280 nm的吸光度(A)值，以RNA電泳檢測其完整性。取總RNA進行cDNA合成，然后用引物按照PCR試劑盒說明書進行擴增。PCR擴增條件如下：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃復(fù)性30 s，循環(huán)40次。AR mRNA表達量以內(nèi)參物GAPDH的相對定量表示。

1.8前列腺癌移植癌PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達水平測定 各組裸鼠瘤組織勻漿后采用RIPA裂解液進行裂解，離心，取上清液測定蛋白濃度，以Western印跡測定瘤組織中AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、mTOR和p-mTOR蛋白表達。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)后加樣后電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、mTOR和p-mTOR抗體，4℃過夜，TBST緩沖液洗膜，加入HRP-羊抗裸鼠IgG，25℃孵育1 h，洗膜，顯色，顯影。AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、mTOR和p-mTOR的表達量以各自吸光度值與β-actin吸光度值的比值表示。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組裸鼠移植瘤生長比較 給藥3 d時實驗組和模型對照組裸鼠移植瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗組裸鼠在給藥后1 w、2 w、3 w和4 w時腫瘤體積較模型對照組顯著降低(P<0.05)。陽性對照組裸鼠移植瘤生長情況與實驗組相似，見表1。

2.2各組裸鼠移植瘤組織AR mRNA表達水平比較 實驗組裸鼠移植瘤AR mRNA表達水平(0.527±0.009)較模型組顯著降低(0.724±0.115，P<0.05)，而模型對照組(0.736±0.112)和陽性對照組裸鼠移植瘤AR mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

表1 各組裸鼠給藥后移植瘤體積比較

與模型對照組比較：1)P<0.05，下表同

2.3各組裸鼠給藥4 w時移植瘤PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較 實驗組裸鼠移植瘤中p-AKT、p-GSK3β和p-mTOR蛋白表達水平較模型對照組顯著降低(P<0.05)，AKT、GSK3β和mTOR蛋白表達顯著升高(P<0.05)，與陽性對照組裸鼠結(jié)果相似，見表2和圖2。

圖1 各組移植瘤AR mRNA表達

表2 各組裸鼠移植瘤PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達比較

圖2 PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白電泳圖

3 討 論

AR是一種細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族中的類固醇受體〔4〕，分布于睪丸組織及睪丸外組織中如前列腺、附睪和癌組織等細胞中。AR 由熱休克蛋白(HSP)70、90、56 組成，是前列腺癌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是其主要的治療靶點。AR被雄激素等配體激活后誘使AR與HSP-90、HSP-70、HSP-56等分子伴侶分離，從而暴露了核轉(zhuǎn)錄信號，使AR二聚體并向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，以高專一性、高親和力與雄激素反應(yīng)元件結(jié)合以發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用〔5,6〕。部分蛋白質(zhì)也可以和AR相互作用，導(dǎo)致基因的激活和去勢抗性〔7〕。在雄激素依賴型前列腺癌中雄激素與AR結(jié)合而刺激前列腺癌細胞的增殖〔8〕。在雄激素非依賴型前列腺癌通過AR表達增加、AR突變、AR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改變等機制，使AR基因呈現(xiàn)出更高的表達活性〔9〕。本研究結(jié)果表明AR shRNA 質(zhì)粒可抑制前列腺癌的增殖及移植瘤中AR的表達，這可能是AR shRNA 質(zhì)粒抑制前列腺癌增殖的機制之一。

PI3K/AKT通路作為細胞內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細胞增殖、凋亡、血管生成等過程中發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能，從而參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程〔10〕。AKT是PI3K的重要下游靶激酶，而p-AKT是信號通路的必要條件，p-AKT可通過激活抗凋亡蛋白Bcl-2及減少促凋亡蛋白Bax 的活化而發(fā)揮其抗凋亡的作用〔11〕。GSK3β是細胞內(nèi)主要的絲氨酸/蘇氨酸家族激酶，也是AKT下游重要靶向分子，通過參與多種信號通路對細胞周期、細胞凋亡、細胞侵襲/轉(zhuǎn)移、血管生成等進行調(diào)控〔12,13〕。GSK3β是多種信號途徑的交匯點，具有廣泛的底物，而磷酸化位點活化是GSK3β活性調(diào)控的主要方式之一。mTOR是一種高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT 信號通路的下游靶點〔14〕。AKT可磷酸化mTOR形成p-mTOR并使其激活，后者促進mRNA翻譯，調(diào)節(jié)細胞代謝、生長增殖及存活等生理活動。本研究表明AR shRNA 質(zhì)粒可以抑制PI3K/AKT通路中AKT、GSK3β和mTOR蛋白的磷酸化從而抑制PI3K/AKT信號通路，這可能是AR-shRNA 質(zhì)粒抑制前列腺癌增殖的機制之一。

1俞 攀，尹彬彬，劉春華，等.雄激素受體負向調(diào)節(jié)雄激素非依賴性前列腺癌細胞FNl和ZNF438基因表達的研究〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2015;95(48)：3935-40.

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6Jehle K，Cato L，Neeb A，etal.Coregulator control of androgen receptor action by a novel nuclear preceptor-binding motif〔J〕.J Biol Chem，2014;289(13)：8839-51.

7Liu LL，Xie N，Sun S，etal.Mechanisms of the androgen receptor splicing in prostate cancer cells〔J〕.Oncogene，2014;33(24)：3140-50.

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