JARID1B對口腔鱗狀細胞癌細胞侵襲、遷移和干細胞樣屬性的影響

胡廣偉 廖天安

(海南省人民醫院口腔科，海南 海口 570311)

口腔癌是一種發生在嘴唇和口腔內的惡性腫瘤，傳統上習慣將它定義為鱗狀細胞癌，因為在牙科學的領域，90%的腫瘤組織學上起源于鱗狀細胞〔1〕。鱗狀細胞癌有不同程度的分化及淋巴結轉移的傾向。JARID1B，也被稱作PLU-1，是成視網膜細胞瘤結合蛋白(RBP)2同系物，是jumonji成員，具有H3K4去甲基化酶活性〔2,3〕，在幾種惡性腫瘤包括膀胱、前列腺、胸腺癌，肺癌等中過表達〔4～7〕。JARID1B與腫瘤細胞遷移、死亡率增加有關，下調JARID1B 可誘導細胞死亡〔8〕。目前，很少研究報道JARID1B對人口腔癌細胞增殖和遷移的作用。本文主要探討JARID1B下調后對口腔癌細胞增殖、遷移及干細胞樣屬性的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 RPMI1640培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)，胎牛血清(FBS)，青-鏈霉素，購自美國Invitrogen；anti-JARID1B購自英國Abcam公司；Oct4A、CD133、Nanog、FOXO1、HIF1alpha和β-actin購自CST。

1.2病人篩選和細胞來源及培養 80例口腔癌患者，男70例，女10例。年齡30～90歲，研究已通過倫理審查，患者均簽署知情同意書。根據AJCC將病人分為4個階段：第一階段9例(11.25%)，第二階段22例(27.50%)，第三階段13例(16.25%)，第四階段36例(45.00%)，其中感染部位在頰黏膜36例(45.00%)，舌頭21例(26.25%)，齒齦7例(8.75%)，其他部位16例(20.00%)。在手術中，分別鉗取距癌灶2 cm的正常黏膜和腫瘤組織，處理后一部分用于病理組織學觀察，一部分用于Western印跡實驗，還有一部分凍存于-80℃保存待用。

人口腔癌細胞系SAS細胞購自ATCC(American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA)。SAS細胞在RPMI1640中培養，RPMI1640培養基中含有10% FBS及青-鏈霉素(100 IU/ml)，在37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.3方法

1.3.1shRNA腺病毒感染 包含有JARID1B shRNA的腺病毒從和元生物有限公司獲得。將SAS細胞接種小皿24 h之后，轉染JARID1B shRNA 48 h。JARID1B shRNA靶標序列為5'-TTCCACAGCTTGCTGA-GATG-3'。

1.3.2劃痕實驗 SAS細胞與shJARID1B處理的SAS細胞(分別為SAS Control組，SAS shJARID1B組)分別接種于六孔板中，孵育48 h。然后用200 μl微量吸液管槍頭沿著板中軸在單層細胞劃痕。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗掉細胞殘渣，新培養基加入六孔板中，37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。檢測劃痕間隙距離。

1.3.3人工基底膜細胞侵襲實驗 用Transwell檢測人工基底膜細胞侵襲。將SAS Control組細胞與SAS shJARID1B組的SAS細胞懸浮于無血清培養基，接種于Transwell小室上層，下層裝有10%FBS全培養基。37℃、5%CO2培養箱培養48 h之后，用棉球擦掉上層沒有遷移的細胞，遷移到下層的細胞用0.1%結晶紫染色，然后在顯微鏡下計數。

1.3.4免疫組化實驗 臨床標本在10%甲醛中固定，并且包埋入石蠟之中；將切片脫蠟和水化。免疫組化染色之前，將脫蠟切片放入37℃烘片2 h，用1%H2O2阻斷內源性過氧化物5 min，PBS洗3次，免疫染色封閉液封閉1 h，之后用抗JARID1B抗體(1∶200)孵育4℃過夜。把切片用PBS洗滌，然后用生物素連接的抗血清室溫下孵育1 h。再次洗滌切片，用3,3-二氨基聯苯胺鹽酸鹽著色1 min。雙蒸水洗滌，蘇木素染色1 min，在顯微鏡下觀察。

1.3.5Western印跡實驗 用細胞裂解液RIPA(蛋白酶抑制劑∶RIPA為1∶1 000)裂解SAS細胞與shJARID1B處理的SAS細胞，制備細胞裂解產物，離心取上清(組織用勻漿機勻漿之后，離心去上清)，用BCA工作蛋白定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，之后電轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，之后不同一抗孵育過夜，包括抗JARID1B,Slug,Vimentin,KLF4,Oct4A和 β-actin，TBST洗滌，孵育相應的二抗，TBST洗滌，用自動顯影儀顯影。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。采用ImageJ軟件及Image Lab軟件對條帶的灰度值進行定量分析。統計圖用GraphPad Prism5軟件分析。

2 結 果

2.1JARID1B高表達于口腔鱗狀細胞癌組織 JARID1B主要分布于正常口腔上皮細胞口腔鱗狀細胞的核，并且JARID1B在口腔鱗狀細胞癌組織中的分布顯著多于正常組織。Western實驗也表明JARID1B顯著高表達于口腔鱗狀細胞癌組織中(P<0.01)，見圖1。

圖1 正常口腔黏膜和口腔鱗狀細胞癌組織中JARID1B的表達

2.2JARID1B調節SAS細胞侵襲增殖能力 Western印跡實驗顯示，轉染shJARID1B腺病毒可沉默JARID1B在細胞中的表達，見圖2。人工基底膜實驗表明下調JARID1B顯著抑制SAS細胞侵襲能力(P<0.01)，見圖3。劃痕實驗結果表明SAS shJARID1B細胞劃痕相對距離顯著少于SAS Control細胞，沉默JARID1B可以抑制SAS細胞遷移(P<0.05)，見圖4。

2.3JARID1B調節SAS細胞多功能性及致癌性 沉默JARID1B顯著抑制Oct4、Nanog、CD133、FOXO1及HIF1alpha表達(P<0.001)。見圖5。

圖2 Western印跡檢測JARID1B的表達

圖3 人工基底膜實驗檢測細胞侵襲能力

圖4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

圖5 沉默JARID1B抑制SAS細胞多能性及致癌因子

3 討 論

口腔鱗狀細胞癌具有干細胞特質，容易對藥物以及輻射產生抵抗〔9～11〕。因此，針對腫瘤干細胞特異性靶標獲得了很大的關注，這也成為強有效的抗腫瘤治療策略〔12〕。JARID1B屬于組蛋白賴氨酸脫甲基酶家族，能夠特異性H3K4的靶基因脫甲基〔13〕。

本文中，Western印跡和免疫組化實驗表明JARID1B在口腔鱗狀細胞癌病人過表達，所以JARID1B可能是口腔鱗狀細胞癌重要的預后因素。JARID1B表達與口腔癌細胞生長、運動有關，并且與干細胞標志物蛋白表達呈正比，如Oct4、Nanog、CD133、FOXO1及HIF1alpha。這些表明JARID1B可能是新型的口腔鱗狀細胞癌標志物。本研究與之前報道相符，Stewart等〔14〕發現其高表達于急性髓性白血病，敲除JARID1B可中和造血干細胞自我更新的能力，從而說明JARID1B正性調節造血干細胞能力。

本文從蛋白水平證明，在口腔鱗狀細胞癌中JARID1B與多能標志物(Oct4、CD113等)有關。證明JARID1B是惡性口腔鱗狀細胞癌有潛力的標志物，也證明JARID1B致腫瘤功能是通過促進腫瘤干細胞樣活性及而促進細胞侵襲、遷移。

本研究發現補充了對于頭頸部腫瘤生物學組蛋白脫甲基的認知，提供了潛在的新型的治療惡性口腔鱗狀細胞癌的靶標。

1Sinevici N,O'Sullivan J.Oral cancer:Deregulated molecular events and their use as biomarkers〔J〕.Oral Oncol,2016;61(1):12-8.

2Tang B,Qi G,Tang F,etal.JARID1B promotes metastasis and epithelial-mesenchymal transition via PTEN/AKT signaling in hepatocellular carcinoma cells〔J〕.Oncotarget,2015;6(14):12723-39.

3Niu X,Zhang T,Liao L,etal.The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein regulates gene expression and tumor growth through histone demethylase JARID1C〔J〕.Oncogene,2012;31(6):776-86.

4黃盛松，朱子奇，孫 莉，等.膀胱癌組織JARID1B表達及其慢病毒表達載體的構建及功能研究〔J〕.上海交通大學學報(醫學版),2010;30(6):693-7.

5湛 敏.Let-7c在非小細胞肺癌增殖和順鉑耐藥中的作用研究〔D〕.長沙：中南大學,2013.

6Xiang Y,Zhu Z,Han G,etal.JARID1B is a histone H3 lysine 4 demethylase up-regulated in prostate cancer〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2007;104(49):19226-31.

7Barrett A,Madsen B,Copier J,etal.PLU-1 nuclear protein,which is upregulated in breast cancer,shows restricted expression in normal human adult tissues:a new cancer/testis antigen〔J〕?Int J Cancer,2002;101(6):581-8.

8Yamamoto S,Wu Z,Russnes HG,etal.JARID1B is a luminal lineage-driving oncogene in breast cancer〔J〕.Cancer Cell,2014;25(6):762-77.

9溫友紅，李 追.安普貼在預防口腔癌患者術中壓瘡的效果觀察〔J〕.現代臨床護理,2011;10(6):23-4.

10王中和.口腔癌的放射治療〔J〕.中國口腔頜面外科雜志,2007;5(5):327-34.

11鄭家偉，鐘來平，張志愿.口腔癌的預防〔J〕.中國口腔頜面外科雜志,2009;7(2):168-75.

12保秋萍，李惠民.腫瘤干細胞的耐藥性與耐藥機制〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復,2011;15(1):116-9.

13Zhao LH,Liu HG.Immunohistochemical detection and clinicopathological significance of JARID1B/KDM5B and P16 expression in invasive ductal carcinoma of the breast〔J〕.Genet Mol Res,2015;14(2):5417-26.

14Stewart MH,Albert M,Sroczynska P,etal.The histone demethylase Jarid1b is required for hematopoietic stem cell self-renewal in mice〔J〕.Blood,2015;125(13):2075-8.