微泡破壞及骨髓間充質干細胞移植治療犬急性心肌梗死模型的有效性

柳淑云 常學鋒 劉旭光

(北京市昌平區中西醫結合醫院心內科，北京 102208)

急性心肌梗死(AMI)是急性危重癥疾病。心肌細胞減少和缺血缺氧是導致心肌梗死晚期出現難治性心力衰竭等癥狀的主要因素。因此，增加有活性的心肌細胞數量是病因上治療心肌梗死的關鍵。研究表明，骨髓間充質干細胞(BMSCs)能夠分化為心肌組織和血管，減輕心室重構〔1〕。而且，最近的臨床試驗表明，移植的異體BMSCs與自體BMSCs同樣可以安全有效地用于心肌細胞再生〔2〕。因此，BMSCs的移植為AMI的治療提供了希望。

1 材料和方法

1.1試劑 DAB顯色酶底物試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。 小鼠單克隆抗BrdU抗體購自上海浩然生物技術有限公司。 L-DMEM培養基購自北京雅安達生物技術有限公司；Percoll分離液(1.073 g/ml)、CD34和CD44兔單克隆抗體、2.5 mm×15 mm OTW球囊，購自美國Gibco公司。

1.2動物 吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心獲得24只健康比格犬，雌雄各半，體重16.0～17.5 kg。

1.3BMSCs 準備 取骨髓：將犬以5%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔麻醉后，用20 ml注射器穿刺抽取犬肱骨骨髓10 ml，加入等體積肝素。離心純化BMSCs，獲得的單核細胞在直徑100 mm的培養皿中接種，培養液內含20%磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.1 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的L-DMEM。在37.0℃，5%CO2下培養。 過24 h更換培養基。細胞生長至68%以上時，細胞以1∶3的比例傳代，48 h更換一次培養基。 用第三代細胞進行測定，MTT比色檢測培養細胞的生長規律。通過CD34和CD44陽性細胞的免疫組化染色鑒定BMSCs。在移植前24 h，加入10 μl BrdU標記液以標記BMSCs。

1.4犬AMI模型的制作 禁食8 h后，3%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔麻醉實驗動物。以Sedinger技術穿刺右側股動脈，置入6 F鞘管。將6 F導管(造影)，自犬右股動脈置入至主動脈根部，注入適量造影劑優維顯，顯示左冠狀動脈前降支(LAD)。用BMW導絲推送6F OTW球囊導管至LAD遠端，使之達第一間隔支和第二間隔支之間，抽除導絲，注入適量造影劑優維顯，以4～6 amt充盈球囊堵塞LAD 4 h后撤除氣囊，造模完畢。

1.5分組 模型成功7 d后，將狗隨機分為4組，每組6只，雌雄各半。(1)PBS組：5 ml生理鹽水沖洗后，用OTW球囊將LAD開口完全堵塞，然后自中心腔由遠及近于2 min內注射PBS。(2)微泡+PBS組：LAD開口，給予超聲輻射：經股靜脈應用微量泵以1.5 ml/min勻速緩慢靜脈注射2.0 ml聲諾維，同時啟動超聲。超聲探頭固定于犬心臟左室乳頭肌水平，觀看短軸切面圖；時間觸發模式，觸發脈沖持續時間2 ms，幀頻(FPS)為0.48，觸發時間間隔2 s，機械指數(MI)1.33，作用時間11 min，深度9～10 cm，強度為1.1 W/cm2，頻率為1.2 MHz，其后操作同PBS組。(3)BMSCs組：以BMSCs取代PBS，余操作同PBS組。(4)微泡+BMSCs組：以BMSCs取代PBS，余操作同微泡+PBS組。

1.6觀察指標 (1)細胞形態學、生長特性、數目及鑒定；(2)BMSCs的體外免疫組化標記；(3)造模時在指引導管內通過注入適量造影劑，查看其在氣囊近端是否受阻，以清楚血流有無阻斷情況；(4)M型超聲、二維超聲心動圖及心肌聲學造影(MCE)測量心功能、灌注缺損面積占左室總灌注面積的百分比(DA)：MCE測量DA；M型超聲測量心功能，包括左室射血分數(LVEF)、舒張末期容積(EDV)、收縮末期容積(ESV)、室壁增厚率(D)、短軸縮短率(FS)、室壁運動異常指數(WMSI)。造模前及造模后4 h、梗死相關冠狀動脈再通后，分別進行心肌造影。選擇每次造影心肌顯影達平臺時灌注缺損面積最小的圖像，應用Matlab軟件計算DA%。

1.7統計學方法 應用SPSS16.0軟件，多組計量資料比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1細胞形態學、生長特性、數目及鑒定 原代培養BMSCs約12 h貼壁，一般3～4 d可以傳代一次。第2代細胞形態以長梭形為主；傳代后呈漩渦生長(圖1)。MTT細胞生長曲線分析，培養第1、2、3代細胞的生長規律基本一致，首先經過1～2 d滯留期，第3天開始進入對數生長期，第7天達到平臺期，此時細胞數目不再增加(圖2)，可行傳代。1 w后獲得BMSCs數量為1×107個，3 w后傳代2次，從第3代細胞中可以獲得足夠數量的BMSCs：107個/盤，共24盤。

圖1 第3代細胞(×100)

圖2 MTT分析各代培養細胞的生長曲線

2.2培養細胞的鑒定 CD34、CD44免疫細胞化學檢測顯示表面抗原CD34呈陰性表達，CD44呈陽性表達(圖3)，這是BMSCs的特異標志。

2.3BMSCs的體外免疫組化標記 在BrdU 摻入BMSCs 24 h后進行免疫組化染色，細胞核染為棕褐色，證明 BrdU 已經摻入細胞核中(圖4)。

2.4造模成功 冠狀動脈造影顯示LAD動脈閉塞。阻塞部位為第一、二間隔支之間，其遠端再無造影劑顯示，血流中斷，證實AMI模型建立成功(圖5)。MCE同步心電圖導聯V1表現出特征性AMI變化，包括弓背向上抬高的ST段與直立的T波連接以形成單個曲線和病理Q波(圖6)。

2.5心功能和DA%的測量 各組造模后4 h心臟功能顯著降低，DA%顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖3 免疫細胞化學檢測BMSCs的表面抗原(DAB染色，×200)

圖4 BMSCs的體外免疫組化染色(DAB染色，×200)

圖5 封堵前降支

圖6 特征性AMI變化

表1 各組EDV、LVEF、FS、D、WMSI和DA測量結果

與造模前比較：1)P<0.05

3 討 論

通常AMI治療包括藥物治療和手術治療，主要手術方法包括冠狀動脈內植入支架和冠狀動脈旁路移植術植入。盡管這些治療方法在挽救和改善患者生活質量方面取得了成功，但沒有取代梗死區丟失的組織，即沒有從根本上解決問題。由于心臟的再生能力很低，需要新的治療方法，以便在細胞和分子水平上培育新的組織并治愈心臟〔3〕。

將足夠的BMSCs安全、準確地歸巢到梗死區是從根本上治療AMI的關鍵。通過同軸整體交換型OTW導管經梗死相關冠狀動脈移植的BMSCs不僅定位準確，而且風險較低，易于操作；診斷超聲介導的微泡破壞可以增加血管通透性，促進BMSCs歸巢到心肌梗死區〔4～6〕。為此，本文建立了犬AMI模型，驗證冠狀動脈內移植和超聲介導的微泡破壞的組合是否可以促進BMSCs準確和有效率地移植到梗死區。

本研究結果表明，BMSCs的移植促進BMSCs在心肌內存活，提高α-肌動蛋白表達，增加了能夠有效收縮的心肌細胞數量，減少了心肌梗死面積和灌注缺陷面積，心臟功能得到了有效改善。

心肌梗死發生后病變局部的微環境是細胞存活的最關鍵因素，他將影響移植細胞的黏附，遷移和定植能力及長期存活〔7〕。因此選擇合適的移植時機非常重要。Gehrke等〔8〕發現在心肌梗死后第7天，血管內皮生長因子(VEGF)的分泌達到高峰，可能此時為移植細胞提供最充分的血供，且在心肌梗死7～15 d，纖維組織開始生成，炎癥反應較前減弱，可能此時對心肌的損害降至最低，此時移植細胞容易存活。

本研究結果也證實了BMSCs移植后能夠存活和分化，這為心肌梗死的干細胞臨床治療提供了借鑒。

1Du M,Schmull S,Zhang W,etal.C-kit(+)AT2R(+) bone marrow mononuclear cell subset is a superior subset for cardiac protection after myocardial infarction〔J〕.Stem Cells Int,2016;2016:4913515.

2Hare JM,Fishman JE,Gorstenblith G,etal.Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy〔J〕.JAMA,2012;308:2369-79.

3Lister Z,Rayner KJ,Suuronen EJ.How biomaterials can influence various cell types in the repair and regeneration of the heart after myocardial infarction〔J〕.Front Bioeng Biotechnol,2016;4(1):62.

4Fakoya AD.New delivery systems of stem cells for vascular regeneration in ischemia〔J〕.Front Cardiovasc Med,2017;4(1):7.

5Liao YY,Chen ZY,Wang YX,etal.New progress in angiogenesis therapy of cardiovascular disease by ultrasound targeted microbubble destruction〔J〕.Biomed Res Int,2014;2014:872984.

6Yousef M,Schannwell CM,Kostering M,etal.The BALANCE Study:clinical benefit and long-term outcome after intracoronary autologous bone marrow cell transplantation in patients with acute myocardial infarction〔J〕.J Am Coll Cardiol,2009;53(24):2262.

7Wang J,de Veirman K,de Beule N,etal.The bone marrow microenvironment enhances multiple myeloma progression by exosome-mediated activation of myeloid-derived suppressor cells〔J〕.Oncotarget,2015;6(41):43992-4004.

8Gehrke I,Gandhirajan RK,Poll-Wolbeck SJ,etal.Bone marrow stromal cell-derived vascular endothelial growth factor (VEGF) rather than chronic lymphocytic leukemia (CLL) cell-derived VEGF is essential for the apoptotic resistance of cultured CLL cells〔J〕.Mol Med,2011;17(7-8):619-27.