阿替普酶對腦出血大鼠血腦屏障損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

凌雪輝 周一心 詹 青 韓 瑛 陸紅梅 秦 勇

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科-神經(jīng)康復(fù)科，上海 200137)

腦出血是發(fā)生于腦血管的最具破壞性的疾病，具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高等特點(diǎn)〔1〕。常規(guī)微創(chuàng)開顱清除血腫手術(shù)能降低死亡率，但其手術(shù)創(chuàng)傷較大，可能對腦部正常組織造成傷害，且不能完全消除血腫，所以臨床上常采用微創(chuàng)手術(shù)聯(lián)合內(nèi)科藥物進(jìn)行治療〔2〕。既往研究認(rèn)為，血腦屏障的破壞導(dǎo)致腦出血患者腦組織發(fā)生嚴(yán)重?fù)p害，誘導(dǎo)腦水腫的產(chǎn)生〔3〕。腦出血后腦水腫的病理變化程度與患者預(yù)后密切相關(guān)〔4〕。阿替普酶是腦出血常用的血腫腔內(nèi)纖溶藥物，但其相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究較少。本文主要研究阿替普酶對腦出血大鼠血腦屏障損傷影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料及儀器 阿替普酶購自上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(BCA)購自上海碧云天生物技術(shù)公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔抗鼠單克隆抗體購自武漢博士得有限公司，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-12兔抗鼠單克隆抗體、MMP-9兔抗鼠單克隆抗體購自美國CST公司，緊密連接蛋白(ZO)-1羊抗鼠單克隆抗體購自美國Abcam公司。立體定向儀購自美國Stoelting公司，電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動物 SD雄性大鼠購自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，體重250～290 g，每6只一籠飼養(yǎng)于室溫20℃～22℃、相對濕度60%、清潔的環(huán)境中，自由飲食和飲水。

1.3腦出血大鼠模型構(gòu)建 造模過程根據(jù)參考文獻(xiàn)〔5〕進(jìn)行并適量改進(jìn)。將大鼠麻醉后固定于鼠板夾上，呈仰臥位，1 ml注射器插入右側(cè)股動脈取血，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。取血后，將大鼠置于立體定位儀上，取俯臥位，使顱頂處于平面水平狀態(tài)。切開顱頂中線皮膚，清除皮下組織并標(biāo)記前鹵，鉆開大鼠顱骨，通過注射器在前鹵右側(cè)3.5 mm位置進(jìn)針，以10 μl/min的速度將100 μl自體動脈血注射入顱內(nèi)，靜置5 min，防止自體動脈血返流，封孔，縫合。將大鼠置于37℃恒溫箱中復(fù)蘇。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù) 大鼠隨機(jī)將分為對照組、腦出血組、阿替普酶組，每組10只。阿替普酶組大鼠在造模30 min后，將2 μl阿替普酶(10 μg/μl)注入血腫處；對照組大鼠在處理時只進(jìn)針不注血；腦出血組為腦出血大鼠并給予等量生理鹽水。

1.5行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 手術(shù)第3天，所有大鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)角和前肢放置實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)：放置一塊與墻面成30°夾角的木板，觀察小鼠向右側(cè)轉(zhuǎn)身的百分比，每只小鼠重復(fù)測試10次。前肢放置實(shí)驗(yàn)：握住實(shí)驗(yàn)動物軀干，確保小鼠前肢能自由活動。將大鼠胡須接觸桌邊，引起同側(cè)前肢伸展即為觸須陽性，每只小鼠每側(cè)重復(fù)測試10次，分析小鼠觸須陽性百分比。

1.6測定大鼠腦水含量 大鼠麻醉處理后，斷頭處死，取出腦組織，迅速稱量濕重，放入100℃恒溫箱中烘干處理，稱量干重。腦水含量=(濕重/干重-1)×100%。

1.7檢測腦組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 Western印跡檢測腦出血組及可替普酶組腦組織中血腦屏障相關(guān)蛋白ZO-1、MMP-2、MMP-9蛋白水平。小鼠采用生理鹽水灌注，冰上收集血腫周圍腦組織標(biāo)本100 mg，取10 mg加入100 μl預(yù)冷的蛋白裂解液，加入4℃組織勻漿液進(jìn)行勻漿，15 000 r/min離心5 min，收集上清。根據(jù)試劑盒說明書檢測所提取蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白分子大小，配置相應(yīng)濃度十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠，加樣，將電壓調(diào)整為80 V，恒壓電泳2 h，直至蛋白條帶到達(dá)凝膠底部。在轉(zhuǎn)膜裝置中加入轉(zhuǎn)膜液，將攜帶目的蛋白的凝膠轉(zhuǎn)移至三明治濾紙上，聚偏氟乙烯(PVDF)膜提前在無水甲醇中激活，覆蓋在三明治上，避免產(chǎn)生氣泡，調(diào)整電壓至100 V，轉(zhuǎn)膜2 h。將PVDF膜置于5%胎牛血清液封閉2 h，加入稀釋一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次×10 min，加入稀釋二抗，室溫孵育90 min，TBST洗膜3次×10 min，加入顯色液，曝光，顯影，定影，凝膠成像系統(tǒng)記錄蛋白條帶，Image J軟件分析蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-T檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 腦出血組及阿替普酶組右側(cè)轉(zhuǎn)角百分比較對照組顯著增加，觸須陽性百分比較對照組顯著降低(P<0.05)；與腦出血組相比，阿替普酶組右側(cè)轉(zhuǎn)角百分比有降低趨勢，觸須陽性百分比有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評分

與對照組相比：1)P<0.05

2.2各組腦水含量比較 腦出血組腦水含量〔(84.145±5.217)%〕及阿替普酶組腦水含量〔(73.321±6.285)%〕均較對照組〔(62.314±3.264)%〕顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；阿替普酶組較腦出血組腦水含量有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各組血腦屏障相關(guān)蛋白ZO-1水平比較 阿替普酶組ZO-1蛋白水平(0.457±0.069)顯著高于腦出血組(0.224±0.023，P<0.05)。見圖1。

圖1 各組血腦屏障相關(guān)蛋白ZO-1水平的變化

2.4各組MMP-9、MMP-12水平比較 與腦出血組比較，阿替普酶組MMP-9蛋白水平顯著升高，MMP-12蛋白水平明顯降低(均P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 各組MMP-9、MMP-12蛋白水平變化

表2 各組MMP-12、MMP-9水平變化

與腦出血組相比：1)P<0.05

3 討 論

近年來，在實(shí)行微創(chuàng)血腫清除術(shù)的基礎(chǔ)上，聯(lián)合藥物治療逐漸得到臨床認(rèn)可〔6〕。本研究表明腦出血組大鼠具有神經(jīng)功能損傷和腦水腫現(xiàn)象，提示造模成功；阿替普酶可一定程度緩解腦出血大鼠腦水腫及神經(jīng)功能損傷。本實(shí)驗(yàn)僅對腦出血大鼠進(jìn)行血腫纖溶藥物注射，并沒有清除血塊及血塊裂解物；且通過向顱內(nèi)注射自體動脈血構(gòu)建模型的方法并不能模擬臨床血管破裂出血的病理變化，因此對于評價阿替普酶治療腦出血的療效具有一定局限性，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)特化的防御結(jié)構(gòu)，維持腦內(nèi)正常生理活動。ZO-1廣泛表達(dá)于血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞，交聯(lián)于肌動蛋白細(xì)胞骨架，并緊密連接相鄰的內(nèi)皮細(xì)胞，形成血腦屏障相對封閉的結(jié)構(gòu)，限制水和物質(zhì)運(yùn)輸，發(fā)揮保護(hù)作用〔7～9〕。腦出血發(fā)生后，引起腦內(nèi)缺血缺氧，直接破壞血腦屏障結(jié)構(gòu)，且血腫裂解物通過活化小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)活性氧、MMP等因子的分泌，破壞血腦屏障連接蛋白，進(jìn)一步加劇腦出血的病理癥狀〔10，11〕。本研究表明阿替普酶有助于維護(hù)腦出血小鼠血腦屏障的完整性。

MMP是鋅鈣依賴性的內(nèi)切酶，可水解細(xì)胞外基質(zhì)，參與內(nèi)皮細(xì)胞的生理過程。機(jī)體在正常條件下，MMP無活性，表達(dá)量極少，但當(dāng)機(jī)體發(fā)生異常，促進(jìn)MMP表達(dá)量增加，裂解為有活性的酶〔12〕。在腦出血等疾病中，MMP可水解血管外基質(zhì)和血腦屏障ZO-1，破壞血腦屏障完整性，導(dǎo)致腦組織的二次傷害〔13〕。MMP-12和MMP-9與腦血管疾病關(guān)系密切〔14〕。研究表明，MMP不僅在腦出血初期水解細(xì)胞外基質(zhì)、破壞血腦屏障的完整性，而且在腦損傷修復(fù)過程中參與血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞增生等，具有雙刃劍作用〔15～17〕。在本研究中，阿替普酶可促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，同時抑制MMP-12的水平，合理調(diào)節(jié)MMP的表達(dá)對于腦出康復(fù)具有重要意義。

綜上，阿替普酶對腦出血大鼠腦水腫、神經(jīng)功能損傷具有一定治療作用，且有助于維護(hù)血腦屏障完整性，可能通過調(diào)節(jié)MMP不同表達(dá)量發(fā)揮作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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