活血化瘀中藥對人永生化角質形成細胞株活血的影響及作用機制

王 生 張 晶 康 康 劉 洋

(唐山市工人醫院皮膚科，河北 唐山 063000)

老年人因激素分泌減少，皮膚腺功能減退和退行性萎縮，屏障功能喪失，易引發多種慢性皮膚病，銀屑病是其中常見的一種〔1〕。目前，銀屑病的發病機制仍未明確，臨床療效不夠理想，探尋安全有效的治療方案具有重要意義。有報道顯示，活血化瘀療法對瘀阻膚絡型的銀屑病有較好的療效〔2〕。本實驗通過腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導人永生化角質形成細胞株Ha-cat在體外模擬銀屑病表皮角質細胞的過快增殖，觀察活血化瘀復方提取物對細胞增殖、凋亡的影響，并進一步分析細胞中Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表達水平，初步探討其治療銀屑病的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 Ha-cat細胞株購于上海慧穎生物科技有限公司；活血化瘀復方：核桃、紅花、丹皮、丹參、玄參等組成，由本院藥劑科提供；細胞增殖與毒性檢測試劑盒購于上海普飛生物技術有限公司；FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購于上海博谷生物科技有限公司；Bcl-2、Bax抗體購于美國CST中國分公司。

1.2方法

1.2.1活血化瘀復方制備 取活血化瘀復方中的藥材用清水煎煮3次，收集濾液，減壓濃縮后真空干燥，得到藥粉，冷藏保存待用。實驗前取藥粉1 g(相當于原生藥2.95 g)，用DMEM細胞培養液分別稀釋至20、25、30 g/L，調節pH7.0后使用。

1.2.2細胞培養與分組 用含胎牛血清的DMEM培養基在37℃ 5%CO2培養箱中孵育Ha-cat細胞。取對數生長期細胞，調整濃度為1×109/L，每孔1×106個細胞接種于6孔板中，培養至80%～90%融合，用50 μg/L TNF-α誘導24 h為模型組，模擬銀屑病表皮角質細胞的過快增殖；再分別以濃度20、25、30 g/L的活血化瘀復方水提物作用造模后的細胞24 h為活血化瘀復方組；以全程僅加DMEM完全培養基的Ha-cat細胞為空白對照組。

1.2.3細胞增殖和凋亡情況檢測 制備Ha-cat細胞懸液，調整密度為1×106/L，接種于96孔板中，分組同1.2.2，達到作用時間。①CCK8法檢測細胞增殖情況，向培養孔中滴加細胞增殖與毒性檢測試劑，37℃ 5%CO2培養2 h，上酶標儀讀取450 nm處吸光度值，計算生長抑制率和IC50。②流式細胞術檢測細胞凋亡情況，0.25%胰酶消化相應培養孔中的細胞，3 000 r/min離心收集細胞，調整細胞濃度后按試劑盒說明進行染色，使用流式細胞儀檢測。

1.2.4Western印跡檢測細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達 RIPA抽提Ha-cat細胞蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，調整濃度至5 g/L，加入緩沖液后95℃靜置10 min。配置分離膠和濃縮膠，待測蛋白樣品電泳，濕法轉移目標蛋白至聚偏氟乙類(PVDF)膜，脫脂奶粉封閉40 min，滴加Bcl-2抗體、Bax抗體，均為1∶1 000稀釋，內參為β-actin抗體(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜，次日滴加HRP標記二抗，室溫靜置90 min，洗膜，ECL顯色，檢測各特異性條帶灰度值。

1.2.5RT-PCR檢測Bcl-2、Bax mRNA表達 Trizol提取Ha-cat細胞總RNA，反轉錄為cDNA。Bcl-2上游引物：5′-CACCCCATCCCGACTGATCT-3′，下游引物：5′-TCTCTCCCTCCGGACTTCTC-3′，片段長度144 bp；Bax上游引物：5′-GTACCCGACCTGTAACCTGA-3′，下游引物：5′-TTTCATCCTCTCCTCCGGCA-3′，片段長度148 bp；內參β-actin上游引物：5′-ACTGCACCTGTAGGCGTTTC-3′，下游引物：5′-CACCTTCCACCTGTCGC TCC-3′，片段長度198 bp。擴增條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環，延伸72℃ 5 s，55℃ 20 s。2-△△Ct法對Bcl-2、Bax基因行相對定量分析。

1.3統計學分析 采用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1活血化瘀復方對TNF-α誘導的Ha-cat細胞形態學影響 空白對照組Ha-cat細胞生長狀態良好，僅少量細胞懸浮于培養液中；模型組細胞形態完整且生長迅速，已鋪滿近90%；活血化瘀復方組細胞數量較模型組明顯下降，細胞體積縮小、間隙增大、碎片增多，細胞間連接減少或消失，但20 g/L劑量組改變程度較25、30 g/L劑量組輕微。見圖1。

2.2活血化瘀復方對TNF-α誘導的Ha-cat細胞增殖和凋亡的影響 活血化瘀復方各劑量組對Ha-cat細胞增殖抑制率均明顯高于空白對照組〔(0.00±1.62)%〕和模型組〔(0.00±0.48)%，P<0.05〕；其中25、30 g/L劑量組對Ha-cat細胞增殖抑制程度〔(59.38±6.59)%、(67.73±2.68)%〕明顯高于20 g/L劑量組〔(9.51±4.93)%，P<0.05〕。模型組Ha-cat細胞凋亡率〔(4.25±1.37)%〕明顯低于空白對照組〔(6.75±0.93)%，P<0.05〕；活血化瘀復方各劑量組細胞凋亡率均明顯高于空白對照組和模型組(P<0.05)；其中30 g/L劑量組〔(29.88±3.20)%〕對Ha-cat細胞凋亡的促進程度明顯高于20、25 g/L劑量組〔(8.61±1.59)%,(13.08±3.61)%，P<0.05〕。

2.3各組Ha-cat細胞Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表達情況 模型組Ha-cat細胞Bcl-2、Bax mRNA和蛋白的相對表達量均明顯低于空白對照組(P<0.05)；活血化瘀復方組各劑量組Bax mRNA和蛋白的相對表達量均明顯高于模型組，且隨劑量的增加逐漸提升(P<0.05)；活血化瘀復方組各劑量組Bcl-2 mRNA和蛋白的相對表達量與模型組相比雖有提升，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖2。

圖1 各組Ha-cat細胞形態學變化(×200)

表1 各組Ha-cat細胞Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表達量比較

與空白對照組相比：1)P<0.05；對模型組相比：2)P<0.05

1：空白對照組；2：模型組；3：20 g/L劑量組；4：25 g/L劑量組；5：30 g/L劑量組圖2 Western印跡檢測各組Ha-cat細胞Bcl-2、Bax蛋白表達情況

3 討 論

細胞凋亡的分子調控機制復雜，多種基因參與其中。相關研究顯示，Bcl-2家族可通過調控線粒體膜蛋白分泌和釋放，參與細胞凋亡的發生、發展〔3〕；Bax為Bcl-2的促凋亡基因，與Bcl-2中的抑制凋亡部分相互結合，發揮拮抗作用，二者共同調控細胞凋亡進程〔4〕。TNF-α在銀屑病發生中發揮重要作用：①TNF-α作為促炎因子，可調節免疫反應相關通路，引發體內強炎癥反應〔5〕；②促進角質形成細胞的增殖〔6〕；③誘導T細胞VEGF mRNA高表達，而該因子在銀屑病增生斑塊形成等病理改變中發揮關鍵作用〔7〕。

活血化瘀方是根據本科多年臨床經驗總結而成，藥物包括桃仁、紅花、丹皮、玄參、丹參、雞血藤、雙花、蛇蛻、厚樸、甘草。桃仁、紅花破瘀通絡；丹參協同行心氣，暢血脈；久瘀必留伏陽，雙花清熱解毒，玄參滋陰降火解毒；丹皮涼血破瘀與雞血藤補血活血，推陳出新，加之配伍蛇蛻祛風止癢，營潤肌膚，厚樸燥濕下氣，甘草調和諸藥，共奏活血化瘀；皮膚甲錯的銀屑病為瘀阻膚絡型，上述組方對其有較好的療效。經前期預實驗發現，作用24 h，活血化瘀方粗提液對Ha-cat細胞的最小抑制濃度為20 g/L，半數致死量為24.50 g/L，相關系數為0.957；作用48 h，半數致死量為21.35 g/L，相關系數為0.872，已無明顯細胞周期。因此，最終將活血化瘀方粗提液干預的低、中、高濃度設定為20、25、30 g/L，作用24 h。

本研究顯示，活血化瘀復方各劑量組均可明顯抑制Ha-cat細胞增殖并促進細胞凋亡，其中25、30 g/L劑量組效果更明顯。進一步分析顯示，給予活血化瘀復方干預后Bax mRNA和蛋白表達水平明顯提升，Bcl-2表達變化不明顯。提示Bax較Bcl-2與銀屑病發病更具相關性，Bax基因可改變角質形成細胞分化水平，當低表達時會引發過度增殖；活血化瘀復方可通過上調Bax基因表達，誘導角質形成細胞凋亡，抑制Ha-cat細胞增殖，緩解銀屑病。同時，Bax基因可能通過與其他基因相互拮抗，而非Bcl-2基因，實現上述促凋亡調控作用，有待進一步研究。

1沈立飛，王海英.黃芪注射液聯合阿維A、復方氟米松軟膏對銀屑病患者外周血細胞因子的影響〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(14)：3546-7.

2趙玉梅.活血化瘀法治療尋常型血瘀型銀屑病臨床療效觀察及對血液流變學影響的研究〔D〕.濟南：山東中醫藥大學，2012.

3陳 敏.皮膚感染患者病原菌種類和耐藥性特點分析〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2015；16(4)：505-7.

4趙一暉，張晶瑩，孫 蘭，等.含醋酸氯已定復方洗手液的安全性研究〔J〕.中國衛生工程學，2016；15(1)：43-5.

5宋琳毅，周乃慧，王淼淼，等.尋常型銀屑病患者血清白細胞介素-22水平與治療轉歸的關系〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(10)：2483-4.

6關 麗，劉冬舟.風濕免疫性疾病患者醫院感染及病原菌分布調查研究〔J〕.中國衛生工程學，2017；16(3)：329-30.

7楊 楠.應用皮瓣修復面部皮膚缺損30例臨床分析〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2017；18(4)：512-4.