慢性阻塞性肺病大鼠血漿白三烯C4水平、細胞免疫及支氣管上皮多藥耐藥相關蛋白1 mRNA和蛋白水平的變化

黃燕玲 羅光偉 毛莉娜

(武漢市第一醫院呼吸內科，湖北 武漢 430022)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是中老年人的常見病和多發病，許多患者最終因呼吸衰竭或慢性肺源性心臟病而死亡〔1～3〕。白三烯(LT)C4是和谷胱甘肽共軛的炎癥產物，與COPD 患者的支氣管黏膜炎癥、支氣管平滑肌收縮和氣道重構的關聯仍未清晰闡明〔4〕；另外多藥耐藥相關蛋白(MRP)1與LTC4有較高親和力〔5〕。本研究探討COPD大鼠血漿LTC4、T淋巴細胞亞群和支氣管上皮MRP1 mRNA表達與COPD的相關性。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級健康Wistar大鼠20只，雌雄各半，體重180～220 g，購于武漢大學醫學動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(鄂)2003-0004。隨機分為模型組和正常對照組各10只。

1.2COPD模型制備 于大鼠氣管內注入脂多糖(LPS)加熏香煙方法制備COPD模型。在第1天和第14天，將大鼠全麻，于氣道注入溶于生理鹽水的LPS 200 μl(1 mg/ml)，正常對照組注入生理鹽水。第2～28天(第14天除外)將COPD組置入自制被動熏吸箱內(50 cm×50 cm×50 cm)，注入香煙煙霧(牡丹牌香煙，上海卷煙廠生產，焦油、尼古丁和一氧化碳(CO)的含量分別為11.0 mg/支、0.9 mg/支和12 mg/支)，濃度5%，1 h/次，2次/d。正常對照組不進行熏吸。

1.3指標檢測 ①呼吸功能測定：采用動物肺功能測定系統檢測肺功能，即1 s用力呼氣容積占用力肺活量的比值(FEV1/FVC)、呼氣峰流速(PEF)和肺順應性(Cydn)。采用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于操作臺，測定肺功能。②酶免疫法檢測血漿LTC4：大鼠處死前經頸總動脈采血3 ml，立即注入預冷的含乙二胺四乙酸鈉(EDTA-Na2)(1 mg/ml)試管中抗凝，4℃，2 000 r/min離心10 min，分離血漿，-70℃保存，備用。采用LTC4 酶免疫檢測試劑盒(美國Cayman Chemical公司)測定大鼠血漿中LTC4水平，具體操作按說明書進行。③T細胞亞群檢測：收集造模前后大鼠的尾巴血1 ml，采用流式細胞儀檢測血T細胞及亞群。④反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術分析MRP1 mRNA表達：用Trizol法提取肺組織中總RNA。MMLV逆轉錄酶和多聚體(Oligo)(dT)37℃下逆轉錄5 min，42℃ 1 h逆轉錄為單鏈cDNA。PCR擴增：采用Taq DNA多聚酶和正反引物(MRP1 上游：5′-CATTGACCCTATCTAACTT-3′，下游:5′-AGGAGAACCATAACCC-3′,208 bp;β-actin上游:5′-GAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′,5′-CACGTCACACTTCATGATGGAG-3′，224 bp)。存在下進行PCR，用β-actin和Marker D512為參照物，按以下步驟行PCR擴增：94℃變性，30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個周期。目標基因檢測：采用瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統觀察結果并進行拍照。采用Quantityone4.6.2分析結果。⑤肺組織標本病理：夾閉左主支氣管，將硅膠管固定于右主支氣，檢測之前將血漿標本用SepPack C18(美國Cayman Chemical公司)分離柱抽提，洗出液用N2吹干，置入試管內，右肺內注射10%甲醛至右肺膨脹邊緣變銳，結扎右主支氣管，置于10%甲醛中固定、脫水、包埋、蘇木素-伊紅(HE)染色并行病理檢查。

1.4統計學處理 采用SPSS16.0軟件進行One Way ANOVA分析。

2 結 果

2.1兩組體重比較 實驗期間，模型組精神反應、活動和毛發較正常對照組差，入組前兩組體重差異無統計學意義(P>0.05)，模型組體重增重緩慢，較正常對照組明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 兩組造模前后體重比較

2.2兩組造模后肺功能比較 兩組肺功能差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

2.3兩組造模后血漿LTC4水平比較 與正常對照組〔(1 102.5±188.2)pg/ml〕比較，模型組血漿LTC4水平〔(2 285.4±183.1)pg/ml〕明顯增高(P<0.01)。

2.4兩組造模前后外周血T細胞亞群比較 造模前，兩組CD3+、CD4+和CD8+差異無統計學意義(P>0.05)；造模后，與正常對照組比，模型組CD3+有降低趨勢，但差異無統計學意義，CD4+明顯降低(P<0.001)，CD8+明顯增高(P<0.05)，見表2。

表2 兩組造模前后外周血T細胞亞群及造模后肺功能比較

2.5兩組肺組織中MRP1 mRNA表達 各擴增條帶曲線下的光密度值Aa與β-actin擴增條帶的光密度值Ab，結果以Aa/Ab×100%表示，與正常對照組〔(3.875±0.658)%〕比較，模型組光密度比值明顯較低〔(1.790±0.410)%，P<0.05〕，RT-PCR產物凝膠電泳也可看見模型組MRP1 mRNA表達較弱，見圖1。

圖1 MRP1 mRNART-PCR產物凝膠電泳圖

圖2 兩組肺支氣管病理學變化(HE，×400)

2.6兩組肺組織形態學病理的變化 由圖2所示，正常對照組支氣管黏膜纖毛柱狀上皮呈整齊排列，黏膜與固有層的細胞數較少，可見少數杯狀細胞，各級支氣管壁黏膜上皮未見大量炎癥細胞浸潤，肺泡完整正常；模型組氣管、支氣管黏膜上皮纖毛大量倒伏和脫落，杯狀細胞明顯增多，各級支氣管管壁周圍大量炎癥細胞浸潤，肺泡斷裂，肺泡壁變薄，腔體擴大。與正常對照組比，模型組肺組織存在明顯的損傷。

3 討 論

COPD發生時，肺不同部位的肺泡巨噬細胞、T 淋巴細胞和中性粒細胞表達增加，炎癥細胞被激活釋放大量炎癥介質，如LTC4、腫瘤壞死因子和白細胞介素等，其中LTC4是和谷胱甘肽共軛的產物，通過增加毛細靜脈的通透性，收縮血管和誘導氧化應激收縮支氣管平滑肌，促進氣道平滑肌增殖，增加液體滲出，進而破壞肺實體結構，導致氣道重構〔6～8〕。本研究結果印證了LTC4參與了COPD的發生發展過程，也顯示COPD患者的血漿的LTC4表達與COPD嚴重程度呈正相關關系〔8～10〕，可見臨床可以LTC4水平為COPD患者提供個體化治療方案或治療COPD的新藥可將LTC4作為藥效靶點。

COPD的發病機制不僅在于肺部出現炎癥反應，還在于全身免疫系統的變化。T淋巴細胞除了參與COPD的炎癥過程，還參與調整COPD的免疫功能，從COPD肺泡關系液可檢測到CD4+和CD8+存在明顯的變化，本研究結果提示肺部感染的COPD患者細胞免疫顯著降低，對外來異物的免疫監控功能降低，導致病毒、細菌等具有抗原性的異物極容易侵入機體進而加重COPD的病情，致使病情延綿不斷甚至死亡，免疫調節指數降低程度與COPD的嚴重程度呈負相關〔11～13〕。

肺支氣管細胞可表達三磷酸腺苷結合盒(ABC)類轉運體，ABC類轉運體可吸入體外的化學異物或有毒物質，通過外排功能達到肺減毒的效應，作為肺的天然屏障，其家族中的重要一員MRP1在健康人肺支氣管上皮有較強的表達。因為MRP1具有較廣泛的跨膜轉運功能和較多的結合底物，使得MRP1通過作用于內源性代謝物，調節細胞內藥物、毒物和藥物代謝產物水平達到調節肺組織氧化應激，減少毒物或異物對人體的損害，是機體天然的防御解毒的重要組成部分。MRP1 對LTC4具有較高的親和力，LTC4與MRP1結合并與MRP1一起排出到細胞外，因此COPD患者支氣管上皮細胞的MRP1表達降低，重度COPD較中等COPD的支氣管上皮細胞的MRP1表達更少，隨著病程的加重，MRPI表達隨之降低。MRP1在COPD的發生發展過程起保護作用〔14～18〕。

綜上，采用氣管注脂多糖加熏香煙方法復制COPD大鼠模型與臨床COPD具有明顯的病理相似性，LTC4很可能參與了COPD支氣管黏膜炎癥、支氣管平滑肌收縮和氣道重構過程；T淋巴細胞失衡提示COPD的細胞免疫功能降低，造成COPD病情延綿難治；MRP1在COPD過程中起保護作用，臨床治療時可根據LTC4、T淋巴細胞和MRP1的表達為COPD患者制定治療方案，用于治療COPD的新藥可將降低LTC4、平衡T淋巴細胞或增加MRP1水平作為療效靶點。

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