MMP-9和緊密連接蛋白Occludin在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部的表達

張子洲

(常州市第七人民醫院呼吸病科，江蘇 常州 213011)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是由肺的彈性減小、氣道和肺泡結構改變所引起的空氣滯留和肺部充氣過度，具有持續存在的氣流受限特征〔1，2〕。COPD發病機制主要是氣道內慢性炎癥、蛋白酶/抗蛋白酶失衡等〔2，3〕，最終引起肺組織結構破壞，肺功能下降。研究表明基質金屬蛋白酶(MMP)-9通過調節細胞外基質(ECM)的降解與生成，參與機體內氣道重構和血管重塑〔4，5〕。肺上皮細胞和肺毛細血管內皮細胞間的緊密連接(TJ)在維持肺泡的上皮機械屏障和通透性發揮關鍵作用〔6〕。Occludin蛋白是被首次發現組成TJ結構蛋白，其C、N末端與閉鎖小帶蛋白(ZO-1、ZO-2和ZO-3)連接并相互作用，是保持肺泡結構穩定和通透性的關鍵部分〔7〕。本實驗研究MMP-9和TJ蛋白Occludin在COPD大鼠肺部的表達。

1 資料與方法

1.1一般資料 Wistar大鼠30只(昆明實驗動物中心)，雌雄各半，體重(180±20)g，鼠齡10 w。試劑：脂多糖、內毒素1 mg/ml(美國Sigma公司)；哈德門牌過濾嘴香煙(山東中煙工業)；一抗：多克隆兔抗Occludin抗體(美國Sigma公司)；二抗：山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(北京中杉金橋生物技術有限公司)；兔抗人多克隆MMP-9抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；MMP-9酶聯免疫分析試劑盒、免疫組化染色(SABC)法試劑盒(北京中山生物技術有限公司)；OLYMPUS CX22顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；HMIAS-2000H病理圖文分析系統，北京鼎永華泰科技有限公司。

1.2動物模型的制備 大鼠隨機分為COPD組和對照組各15只。兩組均使用同種方式飼養，對照組給予正常空氣，COPD組置于煙箱內，被動吸煙(3次/d，30 min/次，第1天每次5支，第2、3天每次10支，以后每次15支)完成COPD模型的建立。所有操作均在無菌條件下進行，兩組大鼠均飼養造模14 w后處死。

1.3標本采集 造模結束后，使用4%的水合氯醛腹腔注射將大鼠麻痹，打開胸腔，夾閉右主支氣管，在氣管下橫行切口處置入硅膠管，緩慢注射生理鹽水灌洗左肺，重復3次，回收灌洗液，過濾、4℃離心、上清液凍存-70℃冰箱中，用于MMP-9的測定。灌洗后剖開腹腔，下腔靜脈采血5 ml、4℃離心、分離出的血清-70℃凍存，用于MMP-9測定。取大鼠左肺組織浸泡固定于4%的多聚甲醛溶液中，常規包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，用于病理形態學分析。

1.4MMP-9的測定 支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清中MMP-9的測定采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5Occludin的測定 肺組織蠟塊切成4 μm切片后采用SABC法進行染色，操作嚴格按照試劑盒說明書進行作。以0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對照，置于光鏡下觀察。SABC染色結果通過圖像分析，測出Occludin表達的平均灰度。

1.6統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1肺組織形態學觀察 對照組雙肺結構正常、無明顯病理變化、無明顯出血點、彈性較好、表面光滑，肺泡結構完整、清晰、大小均勻。COPD組肺泡明顯腫大、顏色灰白，肺泡間隔水腫增寬，肺泡壁斷裂，肺泡結構異常，出血嚴重。見圖1。

圖1 各組肺組織形態(HE)

2.2兩組血清及BALF MMP-9水平比較 COPD組血清及BALF MMP-9水平〔(490.21±25.97)μg/L、(495.52±9.45)μg/L)〕均顯著高于對照組血清中MMP-9水平〔(381.93±19.35)μg/L，P<0.05〕；COPD組BALF與COPD組血清中MMP-9水平差異無統計學意義(P>0.05)；COPD組BALF MMP-9水平顯著高于對照組BALF中MMP-9水平〔(399.29±20.03)μg/L,P<0.05〕。

2.3Occludin在肺組織中的表達 Occludin在對照組大鼠肺泡上皮細胞表達較多，呈棕褐色；Occludin在COPD組大鼠肺泡上皮細胞表達較少，并且COPD組表達的平均灰度(96.68±11.86)明顯少于對照組〔(121.87±13.55),t=5.848，P=0.000〕。見圖2。

圖2 各組肺組織Occludin表達(SABC法，×100)

3 討 論

COPD是由于氣流阻塞導致的慢性氣道疾病，嚴重吸煙者的發病率較高。目前認為MMPs是COPD患者肺部ECM降解最重要的酶類〔8〕。目前認為MMP-9是MMPs中最重要的酶類之一，且與吸煙關系密切，MMP-9能分解氣道和肺組織的ECM和基底膜，參與氣道和肺組織的重塑〔9〕。MMP-9在COPD患者中表達水平上調較為顯著，加之其表達細胞眾多，作用底物廣泛，近年來備受關注，成為國內外內研究的焦點之一。本研究表明COPD組的大鼠通過大量吸煙導致肺部產生慢性炎癥，使MMP-9表達過多，使ECM的降解產物增多，造成堆積，最終導致氣道組織受到破壞和肺氣腫，與鐘曉芃等〔10〕研究結果一致。Russell等〔11〕研究表明MMP-9過度表達在肺氣腫的形成過程中起重要作用，MMP-9通過破壞肺泡基質成分，介導炎癥細胞聚集導致氣流阻塞等參與COPD發病過程。

肺泡上皮細胞與內皮細胞之間的TJ，是保證肺泡結構和功能穩定的主要組成部分。在維持肺泡結構穩定和通透性上TJ蛋白發揮著至關重要的作用。TJ蛋白可以隔離溶液中的分子滲入體內，保持體內環境相對穩定，維持細胞的極性。Occludin是緊密蛋白中的跨膜整合蛋白，保持正常的肺泡上皮屏障的主要組成部分〔12，13〕。Occludin蛋白的表達數量及蛋白活性發生改變，會影響肺泡上皮細胞與內皮細胞之間的TJ，導致肺部細胞的通透性增加，間隙擴大，一些外部物質容易進入肺部引起肺部的炎癥感染。本研究發現，COPD組大鼠肺泡上皮細胞的保護功能改變可能與Occludin的數量及活性變化具有一定的關系。COPD組TJ Occludin數量明顯減少，從而使肺泡上皮細胞與內皮細胞之間的TJ受到破壞，從而導致肺泡膜的完整性、通透性受到影響，最終引起肺部損傷及水腫，與Lee等〔14〕發現Occludin和ZO-1的在血管內皮細胞中的表達和分布與其通透性密切相關的表述基本一致。

綜上，MMP-9參與了COPD的發病過程，MMP-9在COPD大鼠模型中明顯增加。COPD大鼠肺泡上皮屏障功能與Occludin蛋白表達的數量及改變的一系列變化有關。可以通過改變肺泡中MMP-9和Occludin蛋白的表達，阻止COPD病情進一步發展。

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8陳遠驥，王伯章.基質金屬蛋白酶-9與慢性阻塞性肺疾病的研究〔J〕.醫學綜述，2006；12(11)：648-51.

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10鐘曉芃，朱寶玉.基質金屬蛋白酶及組織型金屬蛋白酶抑制物與慢性阻塞性肺疾病的關系〔J〕.國際呼吸雜志，2005；25(6)：455-7.

11Russell RE，Culpitt SV，Dematos C，etal.Release and activity of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 by alveolar macrophages from patients with chronic obstructive pulmonary disease.〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol，2002；26(26)：602-9.

12Bouvry D，Planès C，Malbertcolas L，etal.Hypoxia-induced cytoskeleton disruption in alveolar epithelial cells〔J〕.Am J Res Cell Mol Biol，2006；35(5)：519.

13Van DW，Kreindler JL，Malik AB，etal.Interrelations/cross talk between transcellular transport function and paracellular tight junctional properties in lung epithelial and endothelial barriers〔J〕.Am J Physol Lung Cell Mol Physiol，2007；293(3)：L520.

14Lee HS，Namkoong K，Kim DH，etal.Hydrogen peroxide-induced alterations of tight junction proteins in bovine brain microvascular endothelial cells〔J〕.Microvasc Res，2004；68(3)：231.