復方丹參滴丸對2型糖尿病大鼠代謝、生化指標及缺氧誘導因子-1α/血管內皮生長因子通路的影響

王 薇 王懷清 楊建明 王 穩

(宜昌市第一人民醫院暨三峽大學人民醫院內分泌科，湖北 宜昌 443000)

糖尿病腎病是糖尿病的嚴重并發癥之一，也是導致患者出現終末期腎衰竭的重要病因。有學者提出，高血糖時紅細胞攜氧能力降低，引起腎組織缺氧，導致腎組織病理生理學的改變是推動2型糖尿病(T2DM)向終末期腎病進展的重要通路〔1〕。缺氧誘導因子(HIF)-1α是機體缺氧狀態時的重要轉錄因子，可通過特異性結合靶基因缺氧反應元件(HRE)而啟動靶基因轉錄，從而發揮生理作用〔2〕。血管內皮生長因子(VEGF)是具有該結合位點的一類靶基因，具有促進血管內皮細胞增殖、增強血管通透性等作用〔3〕。近年來學者發現〔4〕，HIF-1α/VEGF通路激活可能是糖尿病腎病的重要發生機制。復方丹參滴丸(DSP)是目前臨床中用于緩解和治療糖尿病腎臟病變、冠心病等的常見藥物之一，但具體作用途徑及機制尚不明確。本文主要研究DSP對T2DM大鼠HIF-1α/VEGF通路的影響及其作用效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取48只6～8周齡的清潔級健康雄性SD大鼠，體重180～210 g，由上海靈暢生物科技有限公司提供，實驗動物生產合格證號：SCXK(滬)2013-0018。以基礎飼料適應性喂養1 w，室溫(25.0±2.0)℃，濕度45%～70%，自然光照，室內保持安靜。

1.2動物分組與造模 按簡單隨機抽樣方法將48只大鼠隨機分為對照組(NC組，n=10)和造模組(n=38)。對照組給予常規飼料喂養；造模組采用高糖高脂飼料喂養4 w后，一次性腹腔注射2%鏈脲佐菌素(STZ)溶液，劑量為30 mg/kg，2 h后恢復高糖高脂飼料喂養，72 h后采集尾靜脈血，以優越型血糖儀(ACCU CHEK Advantage，瑞士羅氏診斷公司)測定2次隨機血糖(RBG)，兩次RBG值均≥16.7 mmol/L則判定為T2DM模型造模成功。本次共有32只大鼠成模，成功率為84.21%。將成模的32只大鼠依據血糖水平分為糖尿病對照組(DM組，n=16)和DSP治療組(DSP組，n=16)，其中DSP組大鼠在STZ注射1 w后給予400 mg·kg-1·d-1的DSP(天士力制藥集團股份有限公司，批準文號：國藥準字Z10950111，規格：薄膜衣滴丸每丸重27 mg)與生理鹽水混懸液治療；NC組及DM組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃，均持續8 w。

1.3處理方法 灌胃最后1 d，留取大鼠24 h尿液，用于24 h尿微量白蛋白(24 h UAlb)的測定。第2天對三組大鼠腹腔注射1%水合氯醛全麻，劑量為40～50 mg/kg。真空管采集下腔靜脈血8 ml，3 000 r/min離心10 min后，取上清夜，-20℃保存，用于糖代謝及生化指標的測定。同時剖腹快速摘取兩側腎臟組織，以冰生理鹽水原位灌洗，洗凈附著的血細胞，分離腎背膜、周圍脂肪組織及血管蒂，電子天平稱量右腎組織。將腎組織放置于冰袋上，剪取大小約為2 cm×2 cm的腎皮質組織塊，經10%中性甲醛液固定后進行常規石蠟包埋，以切片機制成厚度為2 μm的連續切片，分別經過脫蠟、水化等處理后，以PASM染色后行免疫組化檢測。將剩余腎臟組織置于凍存管內，-70℃保存。

1.4觀察指標與方法

1.4.1三組大鼠糖脂代謝及生化指標的檢測 分別采用AU2700全自動生化儀(日本Olympus公司)和自動放射免疫儀(北京百思佳特科技有限責任公司)檢測空腹血糖(FPG)及空腹胰島素(FIns)水平；24 h UAlb采用BNII全自動蛋白分析儀(德國西門子公司)檢測，其含量=尿微量白蛋白的濃度×總尿量；血脂代謝指標：總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及生化指標：肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的測定均采用AU2700全自動生化儀進行測定；胰島素抵抗指數(HOMA-IR)由計算公式FIns×FPG/22.5得到。

1.4.2三組大鼠腎小球細胞外基質(ECM)堆積指數的測定 高倍鏡視野下(×400)隨機觀察20個不重復的腎小球，通過觀察PASM的染色結果，以判斷ECM的堆積情況，從而對腎小球的病變狀況進行評估。以ECM占據腎小球面積百分比為判定標準，其中百分比為0%～25%計為0分，26%～50%計為1分，51%～75%計為3分，76%以上計為4分。三組隨機選取5只大鼠，以平均積分作為三組ECM堆積指數。

1.4.3三組大鼠腎組織中HIF-1α及VEGF表達水平的檢測 采用Western印跡方法進行檢測：剪取右腎皮質組織約100 mg，以磷酸鹽緩沖液(PBS)充分清洗后，加入4℃預冷的組織裂解A液、B液，置于振蕩器中搖勻5 min后，冰浴靜置20 min以提取總蛋白，4℃ 14 000 r/min離心30 s后吸取上清液，置于EP管中，-70℃凍存。采用聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質進行電泳，將蛋白質轉移至PVDF膜上。后經由甲醇浸泡、緩沖液平衡、轉移、脫色等過程后，將PVDF膜(美國Millpore公司)放入一定大小的自封袋內，以0.1 ml/cm2的劑量加入10%的脫脂奶粉(以0.05%的TBST溶解)，室溫封閉2～4 h后移至另一自封袋中，迅速加入劑量為1 ml/cm2的一抗(HIF-1α購自北京博奧森生物技術有限公司，VEGF購自北京中杉金橋生物技術有限公司，均以封閉液稀釋濃度為1∶1 000，β-actin 1∶5 000)，密封后置搖床孵育2 h，4℃過夜。后取出PVDF膜，以TBS液漂洗4次，每次10 min。加入二抗(北京百奧萊博科技有限公司)，封閉、室溫搖床孵育2～3 h，以TBS液漂洗4次，每次10 min。加入Western印跡Lumininol Reagent A液和B液(美國Santa Cruz公司)后，充分混勻，固定于微型曝光盒中送入暗室曝光。以Fluor-s凝膠成像系統(美國Bio Rad公司)分析目的條帶，以目的蛋白的吸光密度×面積與β-actin條帶的比值表示待測蛋白的相對含量。

1.5統計學方法 應用SPSS21.0軟件，計量資料組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。

2 結 果

2.1三組病理檢查結果及ECM堆積指數比較 NC組腎小球結構正常，基底膜及系膜區未見明顯增厚、擴張現象，而DM組及DSP組腎小球基底膜及系膜區呈現明顯腫脹、擴張，DSP組腎小球病變有所減輕。三組大鼠腎小球ECM堆積指數的積分結果顯示，NC組(1.43±0.54)分，DM組(20.56±0.92)分，DSP組(11.80±1.63)分，三組ECM堆積指數整體比較差異均有統計學意義(F=802.819，P<0.05)。DM組及DSP組腎小球ECM堆積指數積分均顯著高于NC組，且DSP組顯著低于DM組(t=-59.396、-19.336、-18.721，均P=0.000)。

2.2三組血清糖脂代謝指標水平比較 三組血清中糖脂代謝指標水平整體比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與NC組比較，DM組及DSP組血清FPG、FIns、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C水平均顯著升高，而HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；除HDL-C外，DSP組其他指標水平均顯著低于DM組(P<0.05)。見表1。

2.3三組血清生化指標水平比較 DM組及DSP組Scr、BUN及24 h UAlb水平明顯高于NC組，DSP組明顯低于DM組(P<0.05)。見表2。

表1 三組血清糖、脂代謝指標水平比較

與NC組比較：1)P<0.05；與DM組比較：2)P<0.05；下表同

表2 三組血清中生化指標水平比較

2.4三組腎組織中HIF-1α及VEGF表達水平比較 DM組與DSP組腎組織中HIF-1α及VEGF相對含量均顯著高于NC組，DSP組顯著低于DM組(均P<0.05)。見表3。

表3 三組大鼠腎組織中HIF-1α及VEGF相對含量比較

3 討 論

糖尿病腎病是導致糖尿病患者發生終末期腎衰竭的一類常見并發癥，發生率為20%～40%，若不進行及早治療，一旦發展為終末期腎病，將縮短患者的5年生存率〔5〕。糖尿病腎病的具體發生機制尚未完全闡明，學者普遍認為其與遺傳易感性、氧化應激機制、細胞因子和生長因子異常增高、多元醇代謝旁路、蛋白激酶C等多種因素及環節密切相關〔6〕。HIF-1α/VEGF通路激活導致腎組織產生血管內皮增生、內皮細胞通透性增加等一系列病理生理改變，已成為學者們研究糖尿病相關并發癥發生機制新的研究方向。

DSP是臨床中廣泛用于治療心血管疾病的一類中成藥，以丹參、冰片和三七等為主要成分，具有緩解心絞痛、改善血管微循環等作用〔7〕。本次研究結果示，DSP組與DM組大鼠腎小球均呈現一定程度的病變，提示DSP可有效改善T2DM所致的腎臟病變。研究進一步發現，DSP可有效改善T2DM腎病大鼠的糖脂代謝及腎功能，分析原因為DSP具有改善微循環障礙、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、清除自由基、調節血脂等多靶點作用，從而改善胰島素敏感性、降低胰島素抵抗〔8〕。

HIF-1α/VEGF通路激活是目前研究較多的造成腎臟疾病的重要機制，HIF-1α是細胞內調節氧代謝的關鍵因子之一，可穩定細胞的缺氧狀態，是目前發現的唯一一種可在特異性缺氧狀態下發揮活性的轉錄因子〔9〕。T2DM早期的高糖毒性可引起機體缺氧，從而激活機體HIF-1α的大量積聚，HIF-1α可通過特異性結合具有HRE結構的下游靶基因，如VEGF等，從而發揮促進血管生成及增強血管通透性的作用，故可見早期腎病診斷指標24 h UAlb水平大大增加〔10〕。有研究以該通路為新的思路，發現格列齊特、苦瓜總皂苷、羅格列酮等對于延緩T2DM所致腎臟損害的進展具有顯著效果〔11～13〕。DSP對T2DM的改善作用是否與HIF-1α及VEGF通路有關，本文進行了進一步的探索。結果說明HIF-1α及VEGF可能參與T2DM腎病的發生發展過程，DSP對T2DM腎損傷的改善作用機制可能與其對HIF-1α/VEGF通路的調控作用有關。

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3Rud′ko AS，Efendieva MK，Budzinskaya MV，etal.Influence of vascular endothelial growth factor on angiogenesis and neurogenesis〔J〕.Vestn Oftalmol，2017；133(3)：75-81.

4郭勇英，張軍芳，賈存勤，等.通心絡聯合外周血間充質干細胞移植對糖尿病足大鼠血管新生 HIF-1/VEGF通路及miR-210表達的影響〔J〕.中國藥理學通報，2015；31(12)：1749-53，1754.

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9范陽華，葉敏華，吳 雷，等.人腦膠質瘤中 RSUME 的 SUMO 化與HIF-1α/VEGF 通路的相關性〔J〕.西安交通大學學報(醫學版)，2015；36(4)：472-8.

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11操 軒，胡亞琳.格列齊特對2型糖尿病大鼠腎臟組織中HIF-1α和VEGF表達的影響〔J〕.皖南醫學院學報，2016；35(1)：8-11.

12陳 偉，田 魯，李 易，等.苦瓜總皂苷對2型糖尿病腎病大鼠腎臟組織中HIF-1α和VEGF表達的作用研究〔J〕.環球中醫藥，2016；9(6)：659-63.

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