地方城市高校開設(shè)動物細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革初探

陳鯤 歐瑾儀 周伯春

摘? 要 為促進(jìn)地方城市高校生命科學(xué)學(xué)院本科學(xué)生建立培養(yǎng)細(xì)胞、制備細(xì)胞、改造細(xì)胞以及基因/細(xì)胞治療的現(xiàn)代生物知識體系和技術(shù)水平，鍛煉實(shí)驗(yàn)思維和提升科學(xué)素養(yǎng)，廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院開設(shè)細(xì)胞生物學(xué)理論與實(shí)驗(yàn)一體化教學(xué)，從教學(xué)的主導(dǎo)思想、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、教學(xué)形式等方面進(jìn)行一系列改革創(chuàng)新。具體以細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)案例，探討實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物課的課程改革情況。

關(guān)鍵詞 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn);動物細(xì)胞原代培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)教學(xué);素質(zhì)教育;相差顯微鏡;實(shí)驗(yàn)室

中圖分類號：G642.423? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1671-489X（2018）18-0111-03

1 前言

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)研究以及細(xì)胞治療過程中普遍應(yīng)用的手段，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、基因工程、細(xì)胞工程、基因/細(xì)胞治療等重要基礎(chǔ)研究及臨床領(lǐng)域，是加強(qiáng)學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)理論課程知識的重要途徑[1]。為了本科學(xué)生深入認(rèn)識細(xì)胞，培養(yǎng)利用細(xì)胞、改造細(xì)胞的現(xiàn)代細(xì)胞知識框架和技術(shù)體系，廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院開設(shè)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程，課時(shí)為36學(xué)時(shí)，細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（12學(xué)時(shí)）貫穿理論和實(shí)驗(yàn)教學(xué)始終。廣州大學(xué)原為廣州市屬高校，地處廣東省會廣州市，歷史悠久。隨著2015年晉升為一本院校，學(xué)院規(guī)模設(shè)備等充實(shí)擴(kuò)大，研究實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)充足，與廣州中醫(yī)藥大學(xué)、廣東藥科大學(xué)同設(shè)大學(xué)城校區(qū)，校際交流緊密，也為進(jìn)一步提升細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)質(zhì)量提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)和豐富經(jīng)驗(yàn)。

2 以素質(zhì)教育為主，著重創(chuàng)新為主導(dǎo)思想

課程結(jié)合翟中和主編的《細(xì)胞生物學(xué)》（第四版，高等教育出版社）與楊漢民主編的《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（第二版，高等教育出版社），教育學(xué)生以批判接受眼光學(xué)習(xí)前輩科研成果，啟發(fā)學(xué)生科學(xué)探索的思路和方法，鼓勵(lì)學(xué)生敢于創(chuàng)新思維，打破常規(guī)，做出合理實(shí)驗(yàn)假設(shè)。同時(shí)，宣講生物倫理學(xué)和善待實(shí)驗(yàn)動物的態(tài)度與法規(guī)，引導(dǎo)學(xué)生合理運(yùn)用科學(xué)技術(shù)，培養(yǎng)一批守法合規(guī)的科研工作者。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的介紹能使學(xué)生對該技術(shù)領(lǐng)域有整體認(rèn)識，了解儀器、方法、材料，熟悉細(xì)胞體外生長、代謝規(guī)律及影響因素[2]。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)包括細(xì)胞原代培養(yǎng)和細(xì)胞傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)直接由體內(nèi)取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，由于其離體時(shí)間短，性狀與體內(nèi)較相似，適用于研究。傳代培養(yǎng)指把體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞生長至高密度時(shí)，分殖至新的培養(yǎng)瓶中傳代，以期獲得大量同種細(xì)胞或穩(wěn)定的細(xì)胞株，延續(xù)細(xì)胞種[3]。下面以原代細(xì)胞培養(yǎng)的學(xué)生實(shí)驗(yàn)為教學(xué)案例進(jìn)行詳述。

實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞分離及原代培養(yǎng)

1）植塊培養(yǎng)法。取1～3日齡的大鼠乳鼠[4]，浸入75%乙醇約15分鐘處死，取出放在大平皿;在超凈工作臺內(nèi)剪開皮膚，剖開腹腔取出需要的組織器官，置于冰冷小平皿;用PBS清洗血液，以銳剪刀修理，去除脂肪和筋膜，移到另一無菌燒杯中;剪成1 mm3小塊后，再次清洗并移入青霉素瓶中;加入胰蛋白酶1 mL，37 ℃慢速振蕩15分鐘，棄去上清液;再把組織塊接種到培養(yǎng)瓶中，共10～15塊，間距0.2～0.5 cm;輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，添含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液10 mL[5];蓋好瓶塞，用封口膠封住，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);隔2～4小時(shí)后，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢轉(zhuǎn)平放，繼續(xù)培養(yǎng);隔24小時(shí)更換培養(yǎng)液，再倒置培養(yǎng)瓶，不貼壁的組織塊取出，貼壁組織繼續(xù)培養(yǎng);培養(yǎng)3～5天后可換液，補(bǔ)充營養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6]。

2）單細(xì)胞培養(yǎng)法（酶解法）取組織的方法同上，取出后把器官放入青霉素瓶中;用PBS緩沖液清洗，剪碎，加入適量的胰蛋白酶，以蓋住細(xì)胞為宜;保持37 ℃搖勻1～2分鐘，注入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化;靜置2分鐘后，棄去上清液，注入2 mL培養(yǎng)液;用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液;吸出細(xì)胞懸液分裝至2～3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基后旋緊瓶蓋;置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量，必要時(shí)可使用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù);用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶后，適當(dāng)旋松瓶蓋，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)[7]。細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后開始貼附在瓶壁上，當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積75%時(shí)記為+++，占50%時(shí)記為++，占25%時(shí)記為+。

3）機(jī)械解離法以之前相同方法處死小鼠，用解剖剪剪開小鼠的腹腔，用鑷子取出小鼠的脾臟;在直徑60 mm培養(yǎng)皿中注入EZ-Sep? Mouse 1X淋巴細(xì)胞分離液4～5 mL，不銹鋼篩網(wǎng)蓋在培養(yǎng)皿上;用注射器活塞輕輕研磨小鼠脾臟，使得分散的單細(xì)胞透過不銹鋼篩網(wǎng)進(jìn)入淋巴細(xì)胞分離液中;把含有脾臟細(xì)胞的分離液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，加入RPMI 1640培養(yǎng)基1 mL[8]，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[9]。當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積75%時(shí)記為+++，占50%時(shí)記為++，占25%時(shí)記為+。

結(jié)果

1）植塊培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1A、圖1B、圖1C所示，觀察到較多的細(xì)胞從組織塊溢出，細(xì)胞數(shù)目較多。該法是一種操作簡易、成功率高的細(xì)胞原代細(xì)胞培養(yǎng)法，大約30%的學(xué)生采用此法，成功率較高。

2）單細(xì)胞培養(yǎng)法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A、圖2B所示，能看到較清晰的貼壁細(xì)胞，細(xì)胞分布均勻。圖2A細(xì)胞數(shù)目較多，記作+++;圖2B細(xì)胞數(shù)目較少，記作++。該法也是比較常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)法。

3）機(jī)械培養(yǎng)法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3A、圖3B所示，能看到較清晰的懸浮的淋巴細(xì)胞，圓球形，細(xì)胞數(shù)目較多，占視野的75%，記作+++。該法常用作懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)法。

討論? 綜上，植塊培養(yǎng)法、單細(xì)胞培養(yǎng)法、機(jī)械培養(yǎng)法都是學(xué)生實(shí)驗(yàn)常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)法。其中植塊培養(yǎng)法是成功率最高，可選材料部位多，操作最簡單的培養(yǎng)方法，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，以組織塊貼壁不掉落為成功。單細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)效果好，需掐準(zhǔn)酶解時(shí)間，防止消化不足或取材不夠，消化過度、細(xì)胞失活的情況發(fā)生。第三種機(jī)械培養(yǎng)法操作較前兩種方法稍復(fù)雜，取材部位有局限，較常用作實(shí)質(zhì)器官細(xì)胞培養(yǎng)。

在教學(xué)進(jìn)程中，針對學(xué)生觀察乳鼠中不同部位細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、組織粘連性的需要，組織學(xué)生分組實(shí)驗(yàn)。每組采用一種取樣方法取同一部位，多組實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄在案，由學(xué)生完成并記錄對比數(shù)據(jù)，摸索最佳實(shí)驗(yàn)效果，共享實(shí)驗(yàn)成果。

3 教學(xué)管理雙管齊下，重視技能訓(xùn)練

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)備時(shí)間長，實(shí)驗(yàn)耗材大，實(shí)驗(yàn)要求高，實(shí)驗(yàn)流程緊。實(shí)驗(yàn)流程包括前期滅菌消毒→實(shí)驗(yàn)材料乳鼠養(yǎng)殖→實(shí)驗(yàn)過程取材→細(xì)胞培養(yǎng)監(jiān)控→形態(tài)學(xué)顯微觀察與記錄→實(shí)驗(yàn)總結(jié)和匯報(bào)。建立周匯報(bào)制度：學(xué)生代表每周匯報(bào)并檢查進(jìn)程，加強(qiáng)師生互動交流，促進(jìn)教學(xué)進(jìn)程。建立實(shí)驗(yàn)室值班制度：每班一把鑰匙，交由學(xué)生組長輪流值日檢查。建立儀器使用登記制

度：學(xué)生使用大型貴重儀器（如相差顯微鏡）需登記使用日期、人員、使用情況。培養(yǎng)學(xué)生自主管理、獨(dú)立完成、愛護(hù)儀器、清潔衛(wèi)生的習(xí)慣，全面提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)素養(yǎng)和技能。

4 創(chuàng)新教學(xué)形式，激發(fā)學(xué)生興趣

開放式課堂[10]? 該課程發(fā)展日新月異，為了使學(xué)生更充分地接觸前沿知識，開闊領(lǐng)域思路，課堂組織形式以講授教材為主，但不局限于教材和課堂教學(xué)，理論教學(xué)以章節(jié)為單位，集文字、動畫、圖像、教學(xué)視頻于一體，有機(jī)組合教學(xué)資料[7];課后組織學(xué)生搜集細(xì)胞工程、試管嬰兒、人造器官等話題材料，制作宣傳海報(bào)等作業(yè)形式;課余邀請外院客座教授講座，滿足學(xué)生直觀感悟和理性認(rèn)識。

開放式討論? 生物領(lǐng)域充滿未知和探索，開設(shè)每周一題、每周一例、每周一匯，引導(dǎo)學(xué)生針對前沿概念、諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)案例、實(shí)驗(yàn)所遇問題等進(jìn)行討論分析，教師認(rèn)真聽取學(xué)生意見，給予參考思路或建議。

開放式實(shí)驗(yàn)? 在實(shí)驗(yàn)課堂中，師生角色發(fā)生改變，轉(zhuǎn)變傳統(tǒng)課堂教學(xué)以教師為中心、學(xué)生被動接受知識的局面，實(shí)驗(yàn)以學(xué)生為主，教師角色從主體變?yōu)橹鲗?dǎo)，從旁指導(dǎo)。在同學(xué)協(xié)助下，學(xué)生動手完成實(shí)驗(yàn)[11]。鼓勵(lì)學(xué)生利用課余時(shí)間，充分利用校內(nèi)外資源，參加創(chuàng)新大賽和“挑戰(zhàn)杯”，組隊(duì)完成開放型實(shí)驗(yàn)課題，如探索有趣實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，簡化原有實(shí)驗(yàn)工作步驟等。

5 結(jié)語

細(xì)胞生物學(xué)是廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生的基礎(chǔ)必修課程，其課程改革有利于培養(yǎng)創(chuàng)新型、實(shí)用型本科人才。本文以動物細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)為例，介紹學(xué)院如何從以素質(zhì)教學(xué)為主、著重創(chuàng)新培養(yǎng)的主導(dǎo)思想入手，輔以教學(xué)管理，注重技能培訓(xùn)的教學(xué)內(nèi)容革新，創(chuàng)新教學(xué)形式，激發(fā)學(xué)生興趣，全面改革細(xì)胞生物學(xué)課程。實(shí)踐證明，改革有助于提升學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)技能，出色地完成生物醫(yī)藥本科人才培養(yǎng)計(jì)劃。

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