解毒化瘀通腑顆粒治療亞急性和慢加急性肝衰竭患者的療效及其對TLR4/NF-κB炎性通路的影響*

劉巧紅 劉江凱 李素領

1．河南中醫藥大學第一臨床醫學院 (河南 鄭州, 450046) 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院脾胃肝膽科

肝衰竭是臨床較為常見的嚴重的肝損傷疾病，其具有病情重、并發癥多、死亡率高的特點[1]，且其死亡率隨并發癥增多而升高。內毒素血癥是導致肝衰竭的重要因素之一，其中尤以TLR4/NF-κB信號傳導通路為主[2，3]。中醫藥在防治肝衰竭腸源性內毒素血癥方面具有明顯優勢，有研究指出中西醫結合治療慢性重型肝炎，其病死率可下降至37.08%[4]。本研究采用解毒化瘀通腑顆粒聯合西藥綜合治療34例亞急性及慢加急性肝衰竭患者，并與僅采用西藥綜合治療的34例患者進行比較。現將結果報告如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 病例均來自河南中醫藥大學脾胃肝膽科及河南省人民醫院感染科2016年3月至2017年3月期間住院的患者，共68例。參照隨機數字表，將研究對象分為試驗組與對照組，各為34例，在觀察過程中，試驗組及對照組分別有3例、5例患者因死亡未完成觀察被剔除。故試驗組中31例，男23例，女8例；平均年齡(46.5±8.7)歲。對照組中29例，男21例，女8例；平均年齡(45.8±6.8)歲。兩組患者在性別、年齡、職業、既往肝病史、合并癥等方面比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 參照2012年版肝衰竭診治指南[5]中亞急性或慢加急性肝衰竭西醫診斷標準。

1.3 納入標準 ①診斷均符合上述標準；②年齡在18～65歲之間；③20%≤PTA≤40%者；④未合并上消化道出血及肝性腦病II期及以上者；⑤中醫辨證無明顯寒濕、陽虛之象者(參照中醫內科黃疸辨證分型)

1.4 排除標準 ①有糖尿病、內分泌病、腫瘤、風濕免疫系統疾病者；②嚴重的心、腦、腎等其他系統疾病和精神障礙者；③近期服用中西藥免疫制劑者；④孕婦和哺乳期婦女以及對藥物過敏者。

1.5 治療方法 ①基礎治療：兩組患者入院后均給予常規西藥綜合治療，包括一般治療、針對病因及發病機制的治療、并發癥治療以及單純血漿置換(1次/3d，每位患者行3～4次)。②試驗組患者在上述基礎治療上加用解毒化瘀通腑顆粒，藥物為茵陳、赤芍、金錢草各30g，黃芩、郁金各15g，大黃10g。由河南中醫藥大學第一附屬醫院散裝顆粒劑藥房統一提供，2次/d，沖服，療程均為30天。

1.6 觀察指標及方法 觀察患者治療前后臨床癥狀改變、肝功能(ALT、AST、ALP、GGT、Alb、TBil、Che)、凝血功能PTA、內毒素(ET)、炎性通路相關指標(TNF-a、IL-6、TLR4mRNA、NF-κBmRNA)。①TNF-a、IL-6采用酶聯免疫吸附法檢測，嚴格按試劑盒說明操作(試劑盒由杭州聯科生物技術股份有限公司提供)。②ET用終點顯色法檢測，嚴格按試劑盒說明操作(試劑盒由廈門鱟試劑實驗廠有限公司提供)。③TLR4mRNA、NF-κBmRNA的收集及檢測：分別于患者入院后第2天清晨、治療30天后清晨，6～7時空腹肘靜脈采血。采集EDTAK2管2ml，后用滅酶槍頭抽取300μl該靜脈全血并加入900μl RNA穩定劑(該RNA穩定劑由北京TIANGEN生物技術有限公司提供)，充分混合后凍存于-80℃保存備用。RNA提取中使用的試劑盒由北京康為生物科技公司提供，嚴格按試劑盒實驗步驟操作。RNA逆轉錄合成cDNA所用試劑盒為HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒，嚴格按試劑盒說明操作。Real-time熒光 PCR反應中，TLR4、NF-κB和內參GAPDH基因引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設計合成，實驗嚴格按照試劑操作步驟。引物序列設計見表1。

表1 引物序列

1.7 療效判定標準 參考2002年《中藥新藥臨床研究指導原則》(試行)，并結合臨床經驗制定。臨床治愈：癥狀、體征消失或基本消失，證候積分減少≥80%；顯效：癥狀、體征明顯改善，60%≤證候積分減少≤80%；有效：癥狀、體征均有好轉，40%≤證候積分減少<60%；無效：癥狀、體征均無明顯改善，甚或加重，證候積分減少<40%。

1.8 安全性及不良反應 及時觀察記錄兩組患者用藥后各種不良反應。

2 結果

2.1 兩組患者治療前后肝功能指標檢測結果 見表1。

表1 兩組患者治療前后肝功能結果比較

與本組治療前比較，☆P<0.05,☆☆P<0.01;與對照組治療后比較，△P<0.05

2.2 兩組患者治療前后PTA及ET檢測結果 見表2。

表2 兩組患者治療前后PTA、ET結果比較

與本組治療前比較，☆P<0.05;與對照組治療后比較，△P<0.05

2.3 兩組患者治療前后TNF-α及IL-6結果比較 見表3。

表3 兩組患者治療前后TNF-α、IL-6指標比較

與本組治療前比較，☆P<0.05;與對照組治療后比較，△P<0.05

2.4 兩組患者治療前后TLR4mRNA及NF-κBmRNA檢測結果 見表4。

表4 兩組患者治療前后TLR4mRNA、NF-κBmRNA水平比較(內參

與本組治療前比較，☆P<0.05;與對照組治療后比較，△P<0.05

2.5 兩組患者臨床療效 見表5。

表5 兩組患者療效比較 [n(%)]

與對照組比較，△P<0.05

2.6 不良反應 患者在治療過程中均未發生明顯不良反應。

3 討論

肝衰竭的發病機制非常復雜，具體發病機制尚不十分明確，其中內毒素血癥(IETM)是促進肝病重癥化與慢性化，導致肝衰竭的重要因素之一。資料顯示病毒性肝炎患者中有35%～65%伴有腸源性內毒素血癥的發生，重癥肝炎患者IETM的出現率為70%～100%，肝硬化則達79%～92%[6]。慢性及重癥肝病患者多伴有不同程度的腸道黏膜結構及功能的改變[7，8]，內毒素易透過受損的黏膜屏障，進而形成IETM。肝衰竭時，肝細胞變性壞死及門脈系統的改變使肝臟不能正常代謝這些有毒物質，積于體內則進一步加重肝損傷，有學者認為“內毒素-巨噬細胞-細胞因子風暴”是其核心環節[9]。近年來研究認為Toll樣受體4(TLR4)是介導內毒素主要毒性成分脂多糖(LPS)誘導細胞激活的主要跨膜受體[10～12]，其中以TLR4/NF-κB信號傳導通路為主[2，3]。LPS與TLR4結合后，引發細胞膜內信號轉導，啟動多種與炎癥反應相關的基因表達，激活NF-κB，導致炎癥介質的釋放[13，14]，如TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β1、白三烯等，加重肝損害。

近年來，中醫藥在防治肝衰竭腸源性內毒素血癥、延長患者生命及改善預后的研究取得一定進展，優勢日益突出[15-17]。中醫學中雖然沒有肝衰竭腸源性內毒素血癥的同義病名，但根據對該病的證候描述及辯證施治，可將其歸屬于中醫學“瘟黃”、“肝瘟”、“黃疸”、“臌脹”、“熱毒證”等范疇。“濕”、“熱”、“毒”、“瘀”貫穿疾病始終[18～21]，為該病主要的病理因素。解毒化瘀通腑方源于我院多年來的臨床經驗方退黃合劑(治療黃疸性肝炎及重型肝炎有顯著療效)。退黃合劑的前期研究表明[22]該方能降低膽汁淤積性大鼠內皮素1(ET-1)的含量、升高Na-K-ATP酶的活性，改善肝臟微循環；臨床研究[23,24]發現口服退黃合劑聯合灌腸能夠改善高膽紅素血癥及重型肝炎患者肝功能，降低膽紅素水平，縮短病程，改善患者預后。解毒化瘀通腑方較退黃合劑，增加了赤芍以增涼血活瘀功效；加大大黃用量以增通腑之功；另方中茵陳苦寒下降，為治療肝膽疾病的要藥，清利濕熱毒邪，是為君藥；黃芩清熱解毒，助茵陳解毒退黃；金錢草清熱利膽，除濕退黃，與黃芩共為臣藥；郁金功專肝膽，行氣活血、涼血逐瘀，能引諸藥直達病所；赤芍與郁金同用以助赤芍祛濕退黃之功。全方共奏涼血解毒、活瘀通腑之功效。

本研究結果，表明肝衰竭患者在西藥綜合治療的基礎上聯合解毒化瘀通腑方，可更好地降低患者血清內毒素水平，改善肝功能，控制病情進展。解毒化瘀通腑方可減輕SALF&ACLF患者臨床癥狀，改善肝臟的膽汁淤積狀態，減輕肝損傷。其作用機制可能是通過促進SALF&ACLF患者內毒素的排泄或者抑制其吸收，減少內毒素的肝臟毒性反應，減輕肝損傷；并通過降低血清內毒素水平，影響患者TLR4/NF-κB信號通路，減少TNF-a、IL-6等相關炎性因子的產生及釋放，減輕肝損傷。

本研究也存在一些不足，研究未能統一肝衰竭的基礎疾病及發病原因，雖收集的病例中乙型肝炎相關肝衰竭的患者占77%，但其他發病原因也可能對本研究的結果產生一定的影響；其次，關于TLR4/NF-κB通路，僅測量了該通路的基因表達，未檢測蛋白表達，數據不夠全面，不能更深入地說明該通路的變化；再次，實驗室檢測指標中選取的炎性因子較少，僅選取了TLR4/NF-κB通路下游的炎性因子TNF-a及IL-6，不能更深入的說明解毒化瘀通腑方對該通路上下游炎性因子的影響。最后，因時間限制，本研究樣本量較小，觀察周期也較短，在一定程度上影響了結果的分析，需要更大規模、更大樣本的科學研究佐證。