胰島素對肝癌細胞增殖、侵襲、凋亡的影響及機制*

李 燕 王衛民 曹 萌 翟倩倩

河南新鄉醫學院第一附屬醫院內分泌科 (河南 新鄉， 453100)

肝癌是一種常見的消化道腫瘤，具有惡性程度高、發病率高、轉移早、預后差等特點，嚴重危害著人類健康，目前尚無有效的治療方法[1]。胰島素是一種多功能的蛋白質激素，具有刺激DNA合成、蛋白質合成和細胞生長的作用，其生理作用的發揮與肝臟、脂肪組織和骨骼肌等靶器官密不可分，中間任何環節缺陷均可導致胰島素抵抗的發生[2]。近些年的研究顯示，胰島素抵抗與肝癌、胰腺癌等腫瘤具有密切聯系[3，4]。而高胰島素不僅可促進惡性腫瘤的生長和演進，且使患者預后差和死亡率增高[5]。胰島素對肝癌細胞的生物學特性影響還未清楚。與肝細胞相關的胰島素信號途徑主要包括MAPK途徑和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑[6]。鑒于此，本研究以不同濃度的胰島素處理人肝癌細胞系HepG2，檢測細胞的增殖、侵襲、凋亡情況，并探討其對PI3K途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人肝癌細胞系HepG2購自ATCC(美國菌種保藏中心)細胞庫。

1.2 主要試劑和儀器 甘精胰島素注射液購自北京賽諾菲安萬特制藥有限公司；CCK8試劑盒購自美國Promega公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自Thermo公司；膜聯蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自碧云天生物技術研究所；活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、PI3K、磷酸化絲氨酸蘇氨酸激酶(pAKT)抗體均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋公司；Transwell板購自美國Corning公司；酶標儀購自美國Bio Tek公司；Matrigel膠、流式細胞儀均購自美國BD公司。

1.3 細胞培養 取出保存在液氮罐中的人肝癌HepG2細胞，置于37℃水浴中快速溶解，轉入含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基中，置于37℃、5% CO2培養箱內培養。細胞達到80%～90%融合時傳代，傳代后正常培養，取生長至對數期的細胞用于實驗研究。

1.4 細胞增殖實驗 取生長至對數期的HepG2細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，以2×104個/孔密度接種于96孔細胞培養板中，設置6個復孔，培養24 h后，分別換用200 μL含不同終濃度的胰島素(5μIU/mL、10μIU/mL、20μIU/mL、40μIU/mL、80μIU/mL)的RPMI1640完全培養基，同時設置空白對照組和陰性對照組，空白對照組只加培養液，無細胞，用于實驗調零。陰性對照組只加細胞和培養液。24h后每孔加入10μL CCK8溶液，37℃孵育4h。利用空白對照組調零，培養板置于酶標儀上，讀取570nm波長各個孔的光密度值(OD)，以平均光密度值分析細胞的增殖能力。實驗重復3次。

1.5 細胞侵襲實驗 采用Transwell法檢測細胞侵襲。用Matrigel覆蓋Transwell小室的上室，鋪膠時盡可能保證膠面平整。風干待用。取生長至對數期的HepG2細胞，用不含胎牛血清的培養基將細胞濃度調整為1×106個/mL，上室中加入200μL細胞懸液，下室加入含有80μIU/mL胰島素的RPMI 1640(含10%胎牛血清)的調節培養基400μL，不做干預為空白對照組。每組平行設置3個復孔，置于細胞培養板中培養24h。實驗結束后，用95%乙醇固定10min，結晶紫染色15min，倒置顯微鏡下(×200)每膜隨機選擇5個視野計數穿膜細胞數，取均值。

1.6 細胞凋亡實驗 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。將生長至對數期的HepG2細胞接種至24孔細胞培養板中，24h后棄掉培養基，加入含終濃度為80μIU/mL胰島素的RPMI1640培養基培養24h，同時設置對照組。然后用磷酸緩沖液洗滌細胞3次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，離心后收集細胞，按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒的說明操作，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 Cleaved caspase 3、MMP-2、MMP-9、PI3K、pAKT蛋白表達檢測 收集經80μIU/mL胰島素培養24h的細胞，加入RIPA裂解液提取細胞中的蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。總蛋白50μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉，洗滌，孵育一抗(Cleaved caspase 3、MMP-2、MMP-9、PI3K、pAKT抗體均按照1∶1000稀釋)，4℃過夜，充分洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗，洗滌，室溫孵育1h，DAB顯色。

2 結果

2.1 胰島素對HepG2細胞增殖的影響 不同濃度的胰島素處理HepG2細胞24h后，CCK8檢測細胞的增殖情況，發現隨著胰島素濃度的升高，細胞增殖能力增強，與對照組比較，差異具有統計學意義(t5=6.450，P5=0.003；t10=8.046，P10=0.001；t20=9.909，P20=0.001；t40=13.091，P40=0.000；t80=13.672，P80=0.000)。其中80μIU/mL胰島素對細胞的增殖能力最強，選擇作為研究濃度，見表1。

表1 不同濃度胰島素對HepG2細胞增殖的影響比較

與對照組比較，**P<0.01

2.2 胰島素對HepG2細胞侵襲的影響 Transwell法檢測各組細胞的侵襲數，Western blot檢測侵襲相關蛋白MMP-2和MMP-9的表達，結果顯示，與對照組比較，胰島素組細胞侵襲數顯著升高(t=12.156，P=0.000)，MMP-2和MMP-9蛋白均顯著上調表達(tMMP-2=17.126，PMMP-2=0.000；tMMP-9=11.272，PMMP-9=0.000)。見圖1，表2。

圖1 胰島素對HepG2細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達圖

()MMP-2MMP-975.9±5.10.129±0.0150.151±0.017162.3±11.2??0.598±0.045??0.416±0.037??

與對照組比較，**P<0.01

2.3 胰島素對HepG2細胞凋亡的影響 80μIU/mL胰島素處理HepG2細胞24h，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，Western blot檢測Cleaved caspase 3蛋白表達，結果顯示，與對照組比較，胰島素組細胞凋亡率顯著降低(t=30.028，P=0.000)，Cleaved caspase 3蛋白顯著下調表達(t=6.690，P=0.003)。見圖2、3及表3。

表3 兩組細胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白的相對表達量比較

與對照組比較，**P<0.01

圖3 兩組細胞Cleaved caspase3蛋白表達圖

2.4 胰島素對PI3K/AKT信號通路的影響 Western blot檢測胰島素對PI3K/AKT信號通路PI3K、p-AKT蛋白表達的影響，結果顯示，與對照組比較，PI3K、pAKT的蛋白表達均顯著升高(tPI3K=16.833，PPI3K=0.000；tpAKT=6.825，Pp-AKT=0.002)。見圖4及表4。

圖4 兩組細胞PI3K、PAKT蛋白表達圖

PI3KpAKT 0.155±0.0160.042±0.0090.721±0.056??0.098±0.011??

與對照組比較，**P<0.01

3 討論

胰島素是一種多功能的蛋白質激素，作為重要的生長因子，除了具有調節代謝外，還能刺激骨細胞、成纖維細胞等眾多細胞的增殖和分化，在腫瘤的發生中也發揮重要的作用[7]。研究顯示，2型糖尿病、胰島素血癥等患者多種腫瘤的發生高于一般人[8]。高胰島素水平患者體內腫瘤的侵襲能力更強，且與其淋巴結轉移、分期有關，將胰島素作用于體外培養的乳腺癌細胞，發現細胞的總數及活力增加，且有時間和濃度的依賴性[9]；在子宮內膜癌細胞中，胰島素具有促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用，且隨著濃度增加，細胞的凋亡降低[10]；動物實驗發現，糖尿病大鼠的惡性腫瘤發生概率增高，且腫瘤增多，潛伏期縮短，胰島素水平升高[11]。

本研究以肝癌為研究對象，檢測胰島素對肝癌細胞增殖、侵襲、凋亡的影響，結果顯示，細胞增殖可隨著胰島素濃度增加上升，細胞侵襲能力升高，細胞凋亡率降低。細胞的侵襲是惡性腫瘤的生物學特性之一，也是惡性腫瘤在發生和發展過程中的危險階段，是患者死亡的主要原因。細胞外基質的降解和重塑是侵襲的基本條件，MMP-2和MMP-9是降低基底膜的主要成分，在腫瘤細胞的侵襲及轉移過程中發揮重要作用[12]。有研究顯示，在肝癌細胞中抑制MMP-2和MMP-9的表達可降低癌細胞的遷移及侵襲能力[13]。本研究結果顯示，胰島素可上調MMP-2和MMP-9蛋白表達，這提示胰島素可通過上調MMP-2和MMP-9表達，阻滯細胞外基質及基底膜的降解，促進肝癌細胞的侵襲能力。細胞凋亡是指在特定時空中發生的，受機體嚴密控制的細胞自殺現象，受到多種基因的調控。Caspase 3是Caspase家族的關鍵成員，在Caspase級聯反應的下游，在受到凋亡刺激后被激活，其活化將使凋亡進入不可逆階段[14]。目前已在肝癌、肺癌等多種腫瘤中得到研究[15,16]。本研究的結果說明胰島素可通過下調Cleaved caspase 3表達抑制肝癌細胞的凋亡。

PI3K/AKT、ERK1/2信號通路的失調與肝癌的發生密切相關[17]。PI3K/AKT是調節癌細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移的關鍵信號通路，PI3K下游有多種效應分子，AKT是其直接靶點和最主要的靶酶，AKT磷酸化后，可增加腫瘤細胞的運動能力，參與細胞的增殖及凋亡過程，可抑制細胞凋亡，發揮抗凋亡作用[18,19]。有研究指出，肝癌細胞中PI3K/AKT信號通路的激活可促進癌細胞的發展進程[20]。本研究檢測胰島素對PI3K/AKT信號通路的影響，發現胰島素可使PI3K、pAKT的表達上升。

綜上所述，胰島素可促進肝癌細胞增殖和侵襲能力，抑制細胞的凋亡，其功能與Cleaved caspase 3、MMP-2、MMP-9蛋白表達及PI3K/AKT信號通路密切相關。本研究中僅僅檢測了胰島素對肝癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響，其他的生物學特性還有待研究。此外，不同腫瘤對胰島素的反應不盡相同，是否還涉及其他的作用機制，及體內外的效應是否一致等問題還需進一步的研究。本研究為胰島素對肝癌細胞的作用研究提供了一定的實驗依據。