3種飼料添加劑對(duì)吉富羅非魚幼魚生長性能、消化酶活性和肝、腸組織結(jié)構(gòu)的影響

朱傳忠，孫陸宇，解文麗，易敢峰

(1.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，北京 100190；2.福建大北農(nóng)水產(chǎn)科技集團(tuán)股份有限公司，福建詔安 363500;3.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建廈門 361005)

羅非魚是我國主要養(yǎng)殖品種，目前總產(chǎn)量位居全國淡水魚產(chǎn)量第五位[1]。吉富羅非魚是遺傳性狀改良的尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[2]，具有生長速度快、出肉率高的特點(diǎn)[3]。隨著羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，其病害問題時(shí)有發(fā)生。飼料中使用中草藥提取物[4-6]、膽汁酸[7-8]、微生態(tài)制劑[9-11]可以提高魚體生長性能，改善魚體健康，增加魚體免疫力。但這3種添加劑對(duì)吉富羅非魚生長性能和健康的影響還鮮見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)探討飼料中添加中草藥提取物、膽汁酸和微生態(tài)制劑對(duì)吉富羅非魚生長性能、腸道消化酶活性、肝臟和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響，以期為羅非魚高效環(huán)保配合飼料的配制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以魚粉、豆粕、菜粕等常規(guī)原料配制成基礎(chǔ)飼料(見表1)。在每千克基礎(chǔ)飼料中分別添加1、2 g的中草藥提取物(福建大北農(nóng)水產(chǎn)科技有限公司生產(chǎn)，由菌陳、大黃、郁金香等按一定比例復(fù)配后，經(jīng)過超微粉碎制成)；0.1、0.2 g的膽汁酸(山東龍昌動(dòng)物科技有限公司生產(chǎn))；1、2 g的微生態(tài)制劑(福建大北農(nóng)水產(chǎn)科技有限公司生產(chǎn)，由枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌通過閃蒸工藝制成的菌粉混合制劑)。共計(jì)配制7組飼料。試驗(yàn)飼料原料均經(jīng)超微粉碎，保證有80%過80目篩，混合均勻后用MY120X2雙螺桿膨化機(jī)(江蘇牧羊機(jī)械裝備有限公司)制粒，調(diào)質(zhì)溫度102 ℃制粒，50～70 ℃烘干后，置于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)藏備用。

1.2 試驗(yàn)用魚與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用吉富羅非魚購自漳州市龍海市，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，用基礎(chǔ)飼料馴化2周，饑餓1 d后挑選大小均勻的483尾實(shí)驗(yàn)魚(32.75±5.75) g，放養(yǎng)于21個(gè)養(yǎng)殖桶(有效容積500 L)中，每桶放魚23尾。試驗(yàn)在循環(huán)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，水源為曝氣自來水。日投喂率為體重的3%，每天等量投喂2次(9∶00和17∶00)，試驗(yàn)周期為45 d。試驗(yàn)過程中每周稱重，以此為依據(jù)調(diào)整投喂量。試驗(yàn)期間水溫23～27 ℃，pH 6～8，溶氧6～8 mg/L，氨氮含量<0.2 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.1 mg/L。

表1 基礎(chǔ)飼料配方與飼料營養(yǎng)成分含量 Tab.1 Feed formulation and nutrient contents of the experimental diets %

注：*由大北農(nóng)水產(chǎn)科技集團(tuán)生產(chǎn)。

1.3 樣品采集與制備

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，饑餓24 h，分別稱量每桶魚的質(zhì)量。隨后，每處理組隨機(jī)撈取6尾，將魚體于冰盤中解剖，分離前腸、中腸和肝臟；肝臟、腸道(前腸、中腸)各切取0.5 cm置于Bouin氏固定液中固定；其余肝臟、腸道用液氮速凍后，放于-70 ℃冰箱保存。

1.4 指標(biāo)計(jì)算、測定方法與切片觀察

飼養(yǎng)期間，每周測定魚體體重，每天記錄魚體攝食、死亡情況，試驗(yàn)開始和結(jié)束測定魚體體重和體長。計(jì)算特定生長率、增重率、成活率、肥滿度等。

特定生長率(SGR)=(lnW2-lnW1)×100%/t

增重率(WGR)=(W2-W1)÷W1×100%

成活率(SR)= (N1-N2)÷N1×100%

肥滿度(CF，g/cm3)=(W/L3)×100

式中:W1為試驗(yàn)魚初始體重(g)；W2為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚的終末體重(g)；t為飼養(yǎng)天數(shù)；N1為試驗(yàn)魚初始尾數(shù)；N2為試驗(yàn)魚終末尾數(shù)；W為試驗(yàn)結(jié)魚的體重(g)；L為體長(cm)。

1.4.2 消化酶活性的測定方法

腸道和肝臟剪碎稱重后，以預(yù)冷的9倍體積的0.85%的生理鹽水勻漿組織。將組織液于4 ℃下3 000 r /min離心10 min，取上清液用于測定消化酶活性。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，按試劑盒說明書操作。蛋白酶的活性采用福林-酚試劑法測定；淀粉酶的活性采用碘-比色法測定；脂肪酶的活性采用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法測定。以37 ℃條件下，每分鐘水解干酪素生成1 μg 酪氨酸作為1 個(gè)活性單位；脂肪酶以37 ℃條件下，每毫克組織在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min 消耗1 μmol 底物為1 個(gè)活性單位；淀粉酶以37 ℃條件下，每mg組織與底物作用30 min，水解1 mg淀粉為1個(gè)活性單位。

1.4.3 腸道和肝臟切片制備與分析

取合適大小的肝臟組織置于Bouin氏固定液中4 ℃過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，透蠟，包埋，切片，37 ℃過夜烘干；蘇木精-伊紅染色法(HE)，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照。

腸道切片的測定指標(biāo)：腸道絨毛數(shù)量；肌肉層厚度(每張圖片隨機(jī)取10個(gè)點(diǎn)測定后取平均值)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPASS 18.0進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan氏多重比較分析組間差異顯著性。描述性統(tǒng)計(jì)值使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P< 0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 3種飼料添加劑對(duì)吉富羅非魚幼魚生長性能的影響

試驗(yàn)期間，試驗(yàn)魚攝食情況良好，未發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)魚死亡。飼料中添加3種添加劑對(duì)吉富羅非魚幼魚生長性能和飼料利用效率的影響見表2。投喂飼料中添加0.2 g/kg膽汁酸的試驗(yàn)魚增重率和特定生長率顯著高于投喂飼料中添加2 g微生態(tài)制劑，其余各組之間差異不顯著。各組間肥滿度差異不顯著。對(duì)照組飼料系數(shù)顯著高于0.2 g/kg膽汁酸組，與其他各組間差異不顯著。肥滿度在各組間差異不顯著。

表2 飼料中添加3種添加劑對(duì)吉富羅非魚生長性能的影響Tab.2 Effect of three additives on growth performance of O.niloticus

注：CK為對(duì)照組；Z1和Z2分別為中草藥1、2g/kg組；D1和D2分別為膽汁酸0.1、0.2 g/kg組；W1和W2分別為微生態(tài)制劑1、2 g/kg組，下同。

2.2 3種飼料添加劑對(duì)吉富羅非魚幼魚腸道消化酶活性的影響

飼料中添加3種添加劑對(duì)吉富羅非魚幼魚腸道蛋白酶活性的影響見表3。由表3可見，各組之間腸道蛋白酶活性差異不顯著。在投喂添加劑的試驗(yàn)組中，微生態(tài)制劑組幼魚腸道蛋白酶活性最高為1 130 U/g prot，中草藥組幼魚腸道蛋白酶活性最低為890 U/g prot。從表3可以看出，雖然各處理組之間幼魚腸道淀粉酶活性差異不顯著，但攝食3種添加劑后的試驗(yàn)魚腸道淀粉酶活性有升高的趨勢(shì)，且低劑量的添加劑組腸道淀粉酶活性高于高劑量添加劑組。攝食添加劑的試驗(yàn)魚中，Z1和D1組的幼魚腸道淀粉酶活性最高為70 U/g prot，N2組幼魚腸道淀粉酶活性最低為40 U/g prot。在添加中草藥提取物組和添加膽汁酸組中，低劑量添加劑組幼魚腸道脂肪酶活性高于高劑量組的，膽汁酸組幼魚腸道脂肪酶活性最高為6.83 U/g prot，中草藥組幼魚腸道脂肪酶活性最低為2.59 U/g prot。飼料中添加2 g中草藥提取物使得試驗(yàn)魚的腸道脂肪酶活性顯著低于微生態(tài)制劑組和飼料中添加0.1 g膽汁酸組。

表3 飼料添加3種添加劑對(duì)吉富羅非魚腸道消化酶活性的影響Tab.3 Effect of three additives on the digestive enzyme activity of O.niloticus U/g prot

2.3 3種飼料添加劑對(duì)吉富羅非魚幼魚腸道和肝臟形態(tài)的影響

2.3.1 3種飼料添加劑對(duì)吉富羅非魚幼魚肝臟形態(tài)的影響

對(duì)照組的試驗(yàn)魚肝細(xì)胞排列整齊，大小均一，細(xì)胞膜分界明顯，肝細(xì)胞索明顯，肝臟細(xì)胞健康。中草藥組試驗(yàn)魚肝細(xì)胞核偏移，細(xì)胞內(nèi)存在大量脂肪液滴等現(xiàn)象；膽汁酸組試驗(yàn)魚的肝細(xì)胞形態(tài)正常，兩組肝細(xì)胞形態(tài)相近；微生態(tài)制劑組的試驗(yàn)魚肝細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核居中，細(xì)胞膜分界明顯(圖1)。

2.3.2 3種飼料添加劑對(duì)吉富羅非魚幼魚腸道形態(tài)的影響

由表4可知，在前腸組織中，攝食微生態(tài)制劑組的厚度最大，攝食飼料添加0.1 mg/kg微生態(tài)組次之，但各組間實(shí)驗(yàn)魚的前腸腸道肌層厚度差異不顯著。在中腸組織中，攝食飼料中添加1 g/kg中草藥，添加0.2 g/kg膽汁酸組，而各組間也差異不顯著。前腸絨毛長度在各組間無顯著差異；1 g/kg微生態(tài)制劑組的中腸絨毛長度顯著高于中草藥組，但與其他組之間無顯著差異。

3 討論

在本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，飼料中添加適量中草藥提取物、膽汁酸和微生態(tài)制劑均有改善試驗(yàn)魚的生長性能的趨勢(shì)，尤其是投喂添加0.2 g/kg膽汁酸的飼料顯著提高了試驗(yàn)魚的增重率和特定生長率。這與對(duì)雜交羅非魚[12](O.niloticus×O.aureus)、加州鱸[13](Micropterussalmodies)、牛蛙[14]Ranacatesbeiana)的研究發(fā)現(xiàn)一致，分析原因可能是膽汁酸能促進(jìn)脂肪乳化，擴(kuò)大脂肪與脂肪酶的接觸面積，加速脂肪的消化吸收，提高脂肪利用率，而脂肪利用率的提高可以減少蛋白質(zhì)作為能量被消耗，從而使更多的蛋白質(zhì)用于肌體生長。

圖1 飼料中添加3種添加劑對(duì)吉富羅非魚幼魚肝臟形態(tài)的影響Fig.1 Effect of three additives on the liver morphology of juvenile O.niloticus

在本試驗(yàn)中，添加1 g/kg的微生態(tài)制劑組特定生長率(SGR)有高于對(duì)照組的趨勢(shì)，但添加2 g/kg的微生態(tài)制劑的試驗(yàn)魚SGR顯著低于對(duì)照組，這與錦鯉(CyprinuscarpioL.)[15]的研究結(jié)果相似，在其飼料中添加過高的微生態(tài)制劑，降低了錦鯉的生長性能，表明過量添加微生態(tài)制劑似乎對(duì)魚的生長存在負(fù)面效應(yīng)。

表4 3種飼料添加劑對(duì)吉富羅非魚幼魚腸道形態(tài)的影響Tab.4 Effect of three additives on the intestinal morphology of juvenile O.niloticus

在本研究中，與對(duì)照組相比，飼料中添加中草藥提取物、膽汁酸和微生態(tài)制劑未對(duì)腸道的淀粉酶和蛋白酶活性產(chǎn)生顯著影響。但發(fā)現(xiàn)飼料中添加0.2 g/kg膽汁酸的試驗(yàn)魚腸道脂肪酶活性顯著高于添加0.1 g/kg的。在對(duì)牛蛙[14]的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.1 g/kg的膽汁酸可以顯著提高其腸道脂肪酶活性，隨著膽汁酸添加量的增加，腸道脂肪酶活力逐漸降低。

在本試驗(yàn)中飼料添加膽汁酸及微生態(tài)制劑均未對(duì)肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。但是投喂添加中草藥提取物組的試驗(yàn)魚，均發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞核位于細(xì)胞一側(cè)，細(xì)胞空泡化等現(xiàn)象。這可能是中草藥添加量過高或含有某種損傷肝細(xì)胞的因子所致[16]。

腸道是機(jī)體消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)、免疫等的重要場所，其腸絨毛數(shù)量和腸道厚度直接影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[17]。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，飼料中添加一定量的添加劑均有增加試驗(yàn)魚的絨毛數(shù)量和肌層厚度的趨勢(shì)，這表明此3種添加劑可改善營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和腸道健康。研究發(fā)現(xiàn)多種添加劑都能提高腸道絨毛長度和肌層厚度，如添加10～20 mg/kg大豆黃酮可顯著促進(jìn)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)腸道組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育和成熟，提高其后腸腸絨毛的長度[18]；飼料中添加0.2 g/kg膽汁酸使得齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)的腸道絨毛數(shù)增加[19]。而添加50 mg/kg糖萜素(山茶科植物籽中提取的三萜皂苷類與糖類的混合物)則顯著提高大菱鲆腸道黏膜厚度[20]。

綜上所述，飼料中添加適量的中草藥提取物(1 g/kg) 、膽汁酸(0.2 g/kg) 、微生態(tài)制劑(1 g/kg)可以改善吉富羅非魚幼魚的生長性能，提高消化酶活性。

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