基于反轉錄轉座子及簡單重復序列標記的裸大麥遺傳多樣性研究

王國榮，華 為，陳功海，龍周鍇，李 博，張文英，徐延浩，*

(1.主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心/長江大學 農學院，湖北 荊州 434025； 2.浙江省農業科學院 作物與核技術利用研究所，國家大麥改良中心，浙江 杭州 310021； 3.荊州市農業科學院，湖北 荊州 434000)

裸大麥(青稞)是青藏高原地區最重要的糧食作物，但其育成品種與種質資源材料的遺傳多樣性水平存在爭議。孟凡磊等[1]、楊平等[2]的研究認為，川藏地區育成青稞品種的遺傳多樣性較低。曾興權等[3]的研究表明，同一來源地區的青稞育成品種遺傳基礎較為狹窄，但不同地區間的遺傳差異較大。Feng等[4]、賴勇等[5]和巴桑玉珍等[6]利用簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR)標記對青藏地區青稞品種與資源材料的群體遺傳結構、地理分化及與重要農藝性狀的關聯分析進行研究，認為青稞育成品種遺傳基礎較為狹窄，但種質資源的遺傳多樣性較高。

反轉錄轉座子是高等植物基因組中廣泛存在的一類可移動的DNA元件[7]，是植物基因組進化的重要動力[8-10]，參與植物性染色體形成[10]。反轉錄轉座子是大麥基因組的重要組成部分[11]，是大麥基因組響應外界脅迫的重要元件[12-13]，并能介導基因缺失[13]，在大麥基因組進化中具有重要作用[13-14]。反轉錄轉座子標記具有靈敏度高、基因組覆蓋度廣、多態性高等特點，適用于遺傳多樣性研究及種質資源鑒定[15-17]。利用分子標記進行遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建、關聯分析研究的報道在動植物中都較為常見[18-20]，然而利用反向反轉錄轉座子擴增多態性(inter-retrotransposon amplified polymorphism,IRAP)、反轉錄轉座子-微衛星擴增多態性(retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism,REMAP)等反轉錄轉座子標記進行大麥遺傳群體結構研究的報道較少[17]，至今未見利用IRAP、REMAP揭示裸大麥育成品系及資源材料遺傳多樣性和遺傳結構的報道。

鑒于此，本研究選取63份來自不同地區的裸大麥品系及西藏裸大麥資源材料，利用10對REMAP標記、13對IRAP標記對這些材料的遺傳多樣性及群體遺傳結構進行研究，并與SSR標記揭示的遺傳多樣及群體結構進行比較分析，從反轉錄轉座子角度豐富裸大麥的遺傳多樣性研究，提供新穎的遺傳多樣性資料，以期更好地解析裸大麥的遺傳基礎，為裸大麥及其種質資源的高效利用提供更多依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試63份裸大麥材料包含36份青海品系、9份西藏野生資源材料、4份西藏品系、5份云南品系、3份江蘇品系、2份國外材料，以及湖北、甘肅、黑龍江、浙江材料各1份(表1)。供試青海、西藏品系由拉薩市農業科學研究所提供。供試西藏野生材料由武漢大學生命科學學院丁毅教授提供。其他材料由浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所國家大麥改良中心提供。

PCR體系中所用10×buffer、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶均購自上海博彩生物科技有限公司，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 DNA提取

取三葉期新鮮葉片，用CTAB小樣法提取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的質量，NanoDrop 2000c超微量分光光度計測定DNA濃度，-80 ℃保存備用。

表1供試裸大麥材料的名稱和來源

Table1Name and origin of hulless barley accessions used in this study

編號名稱來源編號名稱來源No．NameOriginNo．NameOrigin1東北186Dongbei186黑龍江Heilongjiang33北青2Beiqing2青海Qinghai2甘青4Ganqing4甘肅Gansu34北青3Beiqing3青海Qinghai308?23476國外品系Foreignspecies35北青5Beiqing5青海Qinghai4鄂507Edamai507湖北Hubei36北青6Beiqing6青海Qinghai5蘇裸1號Suluo1江蘇Jiangsu37門農1Mennong1青海Qinghai6蘇裸2號Suluo2江蘇Jiangsu38互青Huqing青海Qinghai7南京3Nanjing3江蘇Jiangsu39福8?4Fu8?4青海Qinghai8Inbyf?08?11歐洲Europe40福8?6Fu8?6青海Qinghai9紫點裸Zidianluo青海Qinghai41高原早1號Gaoyuanzao1青海Qinghai10紫黑青裸Ziheiqingluo青海Qinghai42昆侖1Kunlun1青海Qinghai11青海1Qinghai1青海Qinghai43昆侖3Kunlun3青海Qinghai12青海2Qinghai2青海Qinghai44昆侖10Kunlun10青海Qinghai13青海3Qinghai3青海Qinghai45短芒青裸Duanmangqingluo西藏Tibet14青海4Qinghai4青海Qinghai46藏青26Tibet26西藏Tibet15青海5Qinghai5青海Qinghai47仁比16Renbi16西藏Tibet16青海6Qinghai6青海Qinghai481574?西藏Tibet17青海7Qinghai7青海Qinghai491578?西藏Tibet18青海8Qinghai8青海Qinghai501579?西藏Tibet19青海9Qinghai9青海Qinghai511585?西藏Tibet20青海10Qinghai10青海Qinghai521598?西藏Tibet21青海11Qinghai11青海Qinghai5380284?西藏Tibet22青海12Qinghai12青海Qinghai5480315?西藏Tibet23青海13Qinghai13青海Qinghai5580322?西藏Tibet24青海15Qinghai15青海Qinghai5680402?西藏Tibet25青海16Qinghai16青海Qinghai57藏320Tibet320西藏Tibet26青海17Qinghai17青海Qinghai58紫光芒166Ziguangmang166云南Yunnan27青海18Qinghai18青海Qinghai59黑麥10號Rye10云南Yunnan28青海19Qinghai19青海Qinghai60紫光芒Ziguangmang云南Yunnan29青海21Qinghai21青海Qinghai61云香Yunxiang云南Yunnan30青海130Qinghai130青海Qinghai62云裸1號Yunluo1云南Yunnan31青海132Qinghai132青海Qinghai63蕭山立夏黃Xiaoshanlixiahuang浙江Zhejiang32北青1Beiqing1青海Qinghai

標*的系野生資源。

* indicated wild accessions.

1.3 反轉錄轉座子標記分析

IRAP與REMAP標記引物序列見表2。用于IRAP標記的共有13對組合，分別為A1、A2、A3、A4、A10、A1+A11、A2+A11、A6+A13、A12+A13、A1+A2、A1+A5、A12+A14、A13+A14；用于REMAP標記的共有10對組合，分別為A2+A15、A5+A16、A5+A15、A6+A16、A9+A15、A11+A16、A12+A15、A13+A15、A14+A15、A2+A16。

PCR擴增體系(20 μL)：10×buffer 2 μL，25 mmol·L-1Mg2+1.6 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL，5 U·μL-1Taq酶0.3 μL，10 mmol·L-1引物各1 μL，50 ng·μL-1模板DNA 2 μL，ddH2O 11.7 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54～58 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，36個循環；72 ℃延伸10 min。

REMAP標記PCR產物使用質量分數為2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠成像系統(Syngene， G：BOX-CHEMI-XRQ)記錄結果；IRAP標記PCR產物使用質量分數為5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，硝酸銀染色檢測帶紋，數碼相機拍照記錄結果。

表2IRAP和REMAP引物序列

Table2Primer sequences of IRAP and REMAP

編號No．引物名稱Name引物序列Primersequence(5′→3′)A1Sukkula?E0228GGAACGTCGGCATCGGGCTGA2Sukkula?E9900GATAGGGTCGCATCTTGGGCGTGACA3BAGY?1?C2043TCGTCGCCGGCGTCATCTCCA4BAGY?1?4164CGATGTGTTACAGGCTGGATTCCA5Nikita?57CGGATTTGTTCAAGCCTAAACCA6BARE?1?5980?ACTAGGGCATAATTCCAACAAA7BARE?1?92460CTGGCTAGCCAACTAGAGGCTTGCA8BARE?1?E1814TTCCCATGCGACGTTCCCCAACA9BARE?1?C0700ACACACAAAGCATTCCTCCGGA10Sabrina?C0945GCAAGCTTCCGTTTCCGCA11Sukkula?91673TGTGACAGCCCGATGCCGACGTTCCA12BARE?1?5980?GCTAGGGCATAATTCCAACGA13BARE?1?5980?ACCCTAGGGCATAATTCCAACACCA14BARE?1?5980?GTCTAGGGCATAATTCCAACGTA15GA9ACGAGAGAGAGAGAGAGAGAACA16GA9CGAGAGAGAGAGAGAGAGAC

1.4 SSR標記分析

SSR標記引物及其染色體位置信息由澳大利亞莫道克大學李承道教授提供(表3)。SSR擴增體系(10 μL)：10×buffer 1.0 μL，25 mmol·L-1Mg2+0.8 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.2 μL，5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.15 μL，10 μmol·L-1正反向引物各0.5 μL，50 ng·μL-1模板DNA 2 μL，ddH2O 4.85 μL。SSR標記PCR擴增程序：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，54～61 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，33個循環；72 ℃延伸10 min。SSR標記PCR產物使用質量分數為6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，硝酸銀染色檢測帶紋，數碼相機拍照記錄結果。

1.5 數據統計分析

IRAP、REMAP和SSR標記的結果以二進制和基因型記錄，同一位點上具有相同遷移率的條帶記為1，無帶記為0，同時以數字1、2、3 等代表不同等位基因。通過Popgene 32統計分析計算基因頻率、Shannon指數等遺傳參數。以NTSYS-PC軟件計算遺傳相似性系數(genetic similarity coefficient，GS)，按照非加權平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)和SHAN 程序進行聚類分析作圖。利用EIGEN程序進行主坐標分析。以Structure 2.3.1軟件分析群體遺傳結構，估計最佳群體組群數(K)，取值范圍為1～11，將參數iterations設為10 000次，再將burn-in period設為100 000次，重復11次，計算Q參數。當K值持續增大時，通過計算ΔK確定K值[21]。

2 結果與分析

2.1 標記多態性分析

表3SSR標記染色體位置及引物序列信息

Table3Information of SSR primers

REMAP標記片段大小集中于500～3 000 bp之間(圖1-A)，10對標記共檢測到143個等位變異，每標記平均14.30個，變幅7～25個，其中有131個多態性位點，占總條帶數的91.61%，平均多樣性指數為0.303 3，每個位點的有效等位基因數為1.514 6。IRAP標記條帶大小集中于500～2 000 bp(圖1-B)，13對標記共檢測到315個等位變異，每標記平均24.23個，變幅9～58個，其中有303個多態性位點，占總條帶數的96.19%，平均多樣性指數為0.268 2，每個位點的有效等位基因數為1.440 5。16對SSR標記共檢測到38個等位變異(圖1-C)，每標記平均2.38個，條帶集中于100～400 bp，其中有16個多態性位點，多態性位點百分率 100%，平均多樣性指數為0.342 8，每個位點的有效等位基因數為1.610 2。

標記類型不同，單標記所得條帶數及有效變異數差異明顯。SSR標記單標記平均貢獻2.38條條帶，平均有效變異數為2.38；REMAP標記單標記平均貢獻14.30條條帶，平均有效變異數為13.10；IRAP標記單標記平均貢獻24.23條條帶，平均有效變異數為23.31。較之SSR標記，反轉錄轉座子標記的單一標記多態性位點貢獻率較高。

2.2 遺傳相似系數及主坐標聚類分析

反轉錄轉座子標記聚類結果顯示，63份裸大麥材料GS變幅為0.452～0.937，平均值0.674(圖2-A)。其中：紫光芒與紫光芒166間的GS值最大(0.931)，表明二者親緣關系最近；青海21與野生材料80322、80402的GS值最小(均為0.452)，表明其親緣關系較遠(圖2-A)。在GS值0.620水平上，63份祼大麥材料分為2大類。第1大類可進一步分為2個亞類，第1亞類由鄂507、蘇裸2號及Inbyf-08-11組成，第2亞類中包含8份栽培材料和9份野生材料。在GS值0.740水平上，第2亞類中的9份野生材料單獨聚為一個小類(圖2-A)，說明反轉錄轉座子標記可以很好地區分野生裸大麥材料與其他材料。第2大類在GS值0.680水平上以青海1為一個亞類，剩余42份材料為另一亞類。

反轉錄轉座子標記主坐標分析結果顯示(圖3-A)，反轉錄轉座子標記將供試材料分為2大類。第1大類共20份材料包含3個亞類：第1個亞類包含鄂507、蘇裸2號、Inbyf-08-11；第2個亞類是9份野生材料；第3個亞類為其余8份材料。第2大類共43份材料，由青海1和其余42份材料組成。主坐標分析結果與聚類分析結果一致度較高，材料所屬類群界限明顯。

SSR標記聚類結果(圖2-B)顯示，63份裸大麥材料GS變幅為0.351～0.973，平均值0.716。其中：門農1與青海7的GS值最大(1.000)，表明二者親緣關系較近，其次為北青3與青海7、北青3與門農1，GS值均達到0.973；青海6與蘇裸2號的GS值最小(0.351)，表明二者親緣關系較遠。聚類分析表明，在GS值0.620水平上63份裸大麥材料可分為2大類，其中蘇裸1號、蘇裸2號為第1類，其余的61份材料為第2類。第2類在GS值0.660水平上可分為2個亞類，大部分野生裸大麥(8份)包括在第1亞類的21份材料中，裸大麥1579和青海4等40份材料為第2亞類(圖2-B)。SSR標記聚類結果中，野生裸大麥材料沒有被單獨聚為一類。

SSR標記主坐標分析結果(圖3-B)顯示，SSR標記將供試材料分為2大類：第1大類包括黑麥10號等22份材料；第2大類包含2個亞類，即由紫光芒等21份材料組成的第1亞類和由青海8等20份材料組成的第2亞類。主坐標分析中第1大類材料與GS聚類區分的第1大類及第2大類下的第1亞類(紫光芒除外)所屬材料一致，其他GS區分的第2類(紫光芒除外)所屬材料同主坐標分析的第2類材料一致。

2.3 群體結構分析

圖2 基于反轉錄轉座子標記(A)及SSR標記(B)的63份裸大麥材料聚類Fig.2 Cluster result of 63 parent materials based on retrotransposon markers (A) and SSR makers (B)

圖3 63份裸大麥親本材料反轉錄轉座子標記(A)及SSR標記(B)主坐標分析聚類Fig.3 Principal coordinates analysis on 63 hulless barley germplasms with retrotransposon markers (A) and SSR markers (B)

基于反轉錄轉座子標記的數據群體結構分析表明，樣本的等位變異頻率特征類型數K呈持續增大趨勢，當K=2時，ΔK值最大，據此將63份材料分成2個亞群(圖4-A)，分別包含20、43份材料，其中60份材料Q值大于0.7，表明這些裸大麥材料來源單一，遺傳背景簡單，亞類間缺少基因交流(圖5-A)。同反轉錄轉座子標記GS聚類及主坐標分類2個類群的20、43份材料相比，分類一致。

基于SSR標記的數據群體結構分析顯示，樣本的等位變異頻率特征類型數K呈持續增大趨勢，當K=2時，ΔK值最大，據此將63份材料分成2個亞群(圖4-B)，分別包括23、40份材料，其中58份材料Q值大于0.7。這再次證明了這些裸大麥材料來源單一，遺傳背景簡單，亞類間缺少基因交流(圖5-B)。但與主坐標分析、聚類分析所區分的材料大類、亞類所屬類群相比，無明顯重合性。

圖4 基于反轉錄轉座子標記(A)和SSR標記(B)數據的K值與ΔK折線圖Fig.4 ΔK with change of K values based on retrotransposon markers (A) and SSR makers (B)

圖5 基于反轉錄轉座子標記(A)和SSR標記(B)的63份大麥材料群體遺傳結構分析Fig.5 Population structure of 63 hullness barley germplasms based on retrotransposon markers (A) and SSR markers (B)

3 討論

反轉錄轉座子標記是鑒定和區分種質資源材料的有效方法。基于IRAP與REMAP標記可以區分葡萄牙歷史上育成的所有小麥品系[15]。Biswas等[22]在柑橘中的研究也表明，反轉錄轉座子標記是區分柑橘及其近緣種的有效手段。Kim等[23]建立了基于反轉錄轉座子標記的日本梨品質識別方法。杜曉云等[24]利用IRAP 建立柿屬植物指紋圖譜，能有效區分芽變品種。肖炳光等[25]用 IRAP標記的方法對烤煙品種擴增，平均多態性比率達96%，顯著優于其他測試標記分析結果。

在本研究中，IRAP、REMAP、SSR標記分別檢測到315、143、38個等位變化；變異范圍分別為9～58、7～25、2～4個，平均每對引物檢測到24.23、14.30、2.38個。賴勇等[5，26]利用SSR標記對國內外大麥材料進行檢測，檢測出的等位基因變異范圍為2～7個，平均每對標記檢測2.9個。同這些研究相比，反轉錄轉座子標記(IRAP、REMAP)檢測到的等位基因變異范圍更大，平均每個標記檢測到變異數更多，說明反轉錄轉座子水平上的遺傳多樣性分析能揭示更為豐富的裸大麥遺傳結構信息，可為后續育種利用提供更多信息。

賴勇等[5]用SSR標記檢測青稞材料的GS變幅為0.497～0.970，平均0.761；巴桑玉珍等[6]利用SSR標記分析青稞耐寒資源的GS變化范圍為0.469～0.924，平均0.745；尚毅等[27]的研究表明，浙江省裸大麥地方品種遺傳多樣性水平較高。較以上研究，本研究揭示的裸大麥遺傳相似性系數變異幅度更大，GS平均值更小，親緣關系更遠，這可能與本研究中試驗材料地理來源豐富，并且使用了反轉錄轉座子及SSR兩種標記有關。

基于數學模型的群體結構分析中，本研究認為這些裸大麥材料來源單一，遺傳背景簡單，亞類間幾乎沒有基因交流，在育種利用的過程中，可以考慮加大不同類群裸大麥材料之間的交流。本研究SSR標記的群體結構分析與GS聚類結果差異較大，這可能是因為群體結構分析可以降低人為主觀分類對關聯分析的影響，能更準確地了解這些材料的遺傳背景[28]。群體結構分析是關聯作圖的基礎，本研究基于2種標記的群體結構分析結果存在較大差異。在后續關聯分析中，應充分考慮標記類型對關聯分析結果的影響。

本研究中，反轉錄轉座子與SSR標記的GS聚類都將63份裸大麥劃分為2個大的類群，但反轉錄轉座子標記的GS聚類及主坐標分析皆能將野生祼大麥單獨聚為一個小類，而SSR標記聚類結果中野生裸大麥材料未能單獨聚為一類。這種差異可能是由不同標記揭示了基因組不同類型和DNA多樣性所造成的。IRAP和REMAP反映基因組反轉錄轉座子區域的結構變異，SSR標記揭示的是基因組簡單重復序列的多樣性。反轉錄轉座子在植物非生物脅迫應答及基因組進化中起著重要作用[29]。已有充分的證據表明，反轉錄轉座子驅動了大麥基因組進化，是大麥基因組響應外界脅迫的重要元件[12-14]。西藏大麥材料基因組反轉錄轉座子區域出現了不同于其他材料的進化模式是個值得進一步研究的問題。

本研究表明，多標記協同檢測可以揭示材料間更豐富的遺傳背景差異。但本研究未能對不同標記間檢測結果差異化的存在做更深入的探究。基于反轉錄轉座子的標記較常規的SSR標記，提供的信息豐富，用時少，費用低[30]，而且具有檢測區域不同、靈敏度高、多態性好、基因組覆蓋度廣等諸多優勢。對以上2種標記協同區分裸大麥遺傳背景差異化的研究，將有利于發掘常規標記檢測局限區域外有差異化的親本材料，對多標記協同在遺傳多樣性分析、種質鑒定、親緣關系分析及親本選配中的應用提供了實例。

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