桃果實八氫番茄紅素合成酶基因的克隆與表達分析

梁敏華，楊震峰，蘇新國，*，宋春波

(1.廣東食品藥品職業學院 食品學院，廣東 廣州 510520； 2.浙江萬里學院 生物與環境學院，浙江 寧波 315100； 3.華南農業大學 園藝學院，廣東 廣州 510640)

桃(PrunuspersicaL.)是我國重要躍變型果實之一，原產于我國，栽培歷史悠久，全國范圍內現存品種800余個，實際用于栽培食用品種30個左右[1]。果實呼吸躍變是一個復雜的生理生化過程，可生成眾多與色澤外觀、風味、營養品質密切相關的活性物質，如類胡蘿卜素、醛酮類物質、可溶性糖、酚類物質等[2-3]。營養物質的積累以及外觀色澤的持續改善是果實采后成熟衰老的重要標志，類胡蘿卜素的持續合成與積累是果實成熟衰老過程中呈色的一個重要因素[4-5]。

桃果實中類胡蘿卜素的組成及含量會因果實種類、發育過程和采后貯藏環境的差異而有所不同[6-8]。其合成過程遵循類異戊二烯途徑進行，涉及許多酶促反應，其中八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase，PSY)是該合成途徑中的一個關鍵限速酶[9]。2分子C20化合物牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)在PSY的催化作用下生成合成途徑中的第一個類胡蘿卜素八氫番茄紅素[10]。研究發現，GGPP同時也是維生素、赤霉素、葉綠素等代謝產物的前體物質，因而，PSY又是調控植物中碳源流向的關鍵基因之一[11]。近年來，越來越多研究采用基因工程相關技術，結果發現，誘導PSY基因的特異性表達可以顯著增加植物非綠色組織中的類胡蘿卜素含量[12-14]。本實驗以桃果實為材料，采用RACE技術從桃果實中克隆了PSY基因，通過實時熒光定量PCR分析其在不同品種、不同果實發育組織的表達情況，以期為闡明其所編碼的酶蛋白在桃果實類胡蘿卜素生物合成與積累過程的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料

實驗材料分別選取浙江奉化金麗(PrumuspersicaL. Batsch cv. Jinli，黃肉)和湖景(PrumuspersicaL. Batsch cv. Hujing，白肉)兩個品種的花苞、花、葉芽、軟核果(盛花后35～45 d)、硬核果(盛花后55～65 d)。所有樣品不能有機械損傷及病蟲害，并于1 h內運回實驗室進行下一步處理。

1.1.2 主要試劑

不同品種桃果實的發育組織總RNA提取均采用Omega公司的R6827型試劑盒并依照其說明書進行操作。第一鏈cDNA的合成和普通PCR聚合酶采用康為世紀的PCR Amplification Kit(CWBIO)和2×EsTaqMasterMix。RACE克隆反應采用TaKaRa公司的3′、5′-Full RACE cDNA擴增試劑盒。PCR實時熒光定量分析采用Thermo公司的DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成

桃果實不同發育組織總RNA的提取采用Omega公司的植物RNA專用提取試劑盒，無RNase活性DNaseⅠ用于去除總RNA中殘留的微量DNA。以總RNA為模板，康為世紀公司的cDNA合成試劑盒用于合成桃果實發育組織的反轉錄第一鏈cDNA。

1.2.2 PSY基因序列克隆與生物信息學分析

根據植物學分類原理，從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫搜索與桃果實同源性較高的植物PSY氨基酸序列，通過氨基酸序列比對分析，查找氨基酸保守區域，利用在線軟件(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html)在相鄰氨基酸保守區域分別設計上下游簡并引物(表1)。以反轉錄第一鏈cDNA為模板，加入上下游簡并引物和普通PCR聚合酶進行PCR擴增反應，PCR程序如下：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個循環；72 ℃延伸2 min。PCR產物經純化、轉化、測序得到桃果實中PSY基因的核苷酸序列片段。以上述PSY核苷酸序列為模板，分別設計PSY基因5′-RACE和3′-RACE特異引物(表1)，采用RACE試劑盒進行嵌套式PCR反應，PCR產物經純化、轉化、測序得到PSY基因5′和3′末端核苷酸序列片段。

采用DNAMAN5.2.2軟件對以上測序得到的核苷酸序列片段進行拼接得到PSY全長cDNA序列。ExPASy在線軟件用于確定PSY基因開放閱讀框(http://web.expasy.org/translate)及預測氨基酸、蛋白質性質等(http://web.expasy.org/protparam)。NCBI及GeneDoc2.7.0軟件用于分析比對PSY蛋白氨基酸序列。在線軟件Predictprotein(https://www.predictprotein.org)用于預測PSY蛋白的亞細胞定位及二級結構。基于同源建模原理，使用SWISS-MODEL服務器(http://swissmodel.expasy.org)進行PSY蛋白三級結構的預測及展示。采用MEGA5.1軟件進行PSY基因系統進化樹分析。

表1本試驗所用引物

Table1Primers used in this study

基因名稱Genename引物序列?(5′?3′)Primersequence用途PurposePpPSYForward：GGGCTATTTGGGCTATTTAYGTNTGGTGReverse：TCCCGGTTCAGCTCAGTAACNCCYTTYTC中間片段擴增Intermediatefragmentamplification3′?GSP1：ATTTCCCGTTGACATTCAGCCATTCAAAGATA3′?GSP2：TACTGCTATTATGTTGCTGGGACTGTTGGATT3′?RACEPCR擴增3′?RACEPCRamplification5′?GSP1：TCCAACAGTCCCAGCAACATAATAGCAGTAGAG5′?GSP2：CATATCTTTGAATGGCTGAATGTCAACGGGAAA5′?RACEPCR擴增5′?RACEPCRamplificationForward：TATTATGTTGCTGGGACTGReverse：GTGTTTGTGAGCTGATTCG實時熒光定量PCRRealtimefluorescencequantitativePCRPpTEF2Forward：GGTGTGACGATGAAGAGTGATGReverse：TGAAGGAGAGGGAAGGTGAAAG內參Internalreference

* H = A/T/C；R = A/G；Y = C/T；N = A/T/C/G。

1.2.3 實時熒光定量PCR

根據PSY基因全長核苷酸序列在其編碼區內設計實時熒光定量PCR引物(表1)。以反轉錄第一鏈cDNA為模板，采用Mx3000P 實時熒光定量PCR儀(Agilent)進行三步法擴增分析。反應總體系為25 μL，其中包含cDNA 1 μL、上下游引物(100 μmol·L-1)各1 μL、SYBR Green PCR混合液(Thermo Scientific)13 μL、DEPC水9 μL。PCR程序如下：95 ℃預變性7 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，40個循環；72 ℃延伸15 s。以PpTEF2作為內參基因[15]，每個反應進行3次生物學重復，并設置陰性對照。最終結果分析采用2-ΔΔCT法。實驗數據采用OriginPro9.0軟件進行分析并作圖，結果表示為平均值±標準偏差。實驗結果采用Duncan氏新復極差法進行顯著性分析(P≤0.05)。

2 結果與分析

2.1 PSY基因的克隆與生物學分析

2.1.1 基因克隆與凝膠分析

以反轉錄第一鏈cDNA為模板，采用RT-PCR技術反應得到桃果實中PSY基因的核苷酸序列片段，長度為639 bp(圖1)。以上述核苷酸片段為模板分別設計5′RACE和3′RACE特異引物，通過RACE擴增技術獲得桃果實中PSY基因5′和3′端核苷酸序列片段(圖1)。準確拼接上述序列片段獲得桃果實PSY基因全長核苷酸序列。BLAST比對顯示，克隆獲得的PSY基因核苷酸全長序列與其他植物的PSY具較高同源性，因此將它命名為PpPSY。

2.1.2 氨基酸序列同源性比對與系統進化樹分析

ExPASy在線軟件分析顯示，PpPSY基因具有完整的開放閱讀框，長度為627 bp，編碼208個氨基酸，其中酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)與堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸)比例為6∶7，編碼蛋白分子量23.6 ku，等電點9.04，呈弱堿性，不穩定，親水指數-0.361，水溶性較好(圖2)。

M， 100 bp DNA Marker；1， RT-PCR產物；2， 3′RACE產物；3， 5′RACE產物M， 100 bp DNA Marker; 1， The product of RT-PCR; 2， The product of 3′RACE; 3， The product of 5′RACE圖1 桃果實PSY基因cDNA PCR擴增Fig.1 Amplification for the cloning of PSY gene cDNA from peach fruits

a， 蛋白功能結構域預測；b， 氨基酸序列同源性比較a， Protein functional domains prediction; b， Homology comparison of putative amino acids’ sequence圖2 PpPSY蛋白功能結構域預測及氨基酸多重序列比對Fig.2 PpPSY protein functional domains prediction and multiple alignment of the putative amino acids’ sequence

參照從其他物種上獲得9條與桃果實PpPSY同源性較近的PSY編碼的氨基酸序列，序列比對結果及功能結構域分析顯示(圖2)，第59～83位氨基酸屬于八氫番茄紅素合成酶特異識別域，第1～173位氨基酸屬于Trans_IPPS_HH保守結構域，包含底物結合位點、Mg2+結合位點、活性位點殘基蓋、催化殘基、天冬氨酸富集區等功能結構域，其屬于isoprenoid biosynthesis enzymes Class 1超級家族。進化樹分析顯示(圖3)，PpPSY與同屬薔薇目的梅果實PmPSY(gi|133251410)聚類于一個分支內，親緣性好，可信度高。

圖3 PpPSY基因系統發生樹Fig.3 Phylogenetic trees of PpPSY gene

2.1.3 酶蛋白亞細胞定位與二、三級結構分析

通過Predictprotein在線軟件進行亞細胞定位及二級構件預測分析，結果表明，PpPSY蛋白定位在葉綠體上，二級構件中α-螺旋元件占60.58%，無規則卷曲元件占38.94%，β-折疊元件占0.48%，其中α-螺旋元件與無規則卷曲元件占主要比例，這與使用SWISS-MODEL服務器預測得到的蛋白質三級結構結果基本吻合(圖4)。

2.2 PSY基因在桃果實不同發育組織中的表達分析

以桃果實反轉錄第一鏈cDNA為母液進行等梯度稀釋，并以稀釋液為模板，加入PpPSY特異熒光定量PCR引物進行反應，以檢測PCR擴增效率及擴增產物特異性。結果表明，PCR擴增反應效果良好，擴增效率為90.9%，擴增產物熔解曲線在溫度為80.0 ℃時出現溶解單峰，產物特異性強。PpPSY基因在金麗和湖景果實發育組織中的表達情況因品種不同而有差異，以白肉品種湖景的花苞的表達量作為初始值并設定為1，實驗結果表明(圖5)，PpPSY在黃肉品種金麗花苞、花、葉芽、軟核果、硬核果中的表達均高于白肉品種湖景，且在花苞、花、硬核果中的表達顯著高于湖景品種(P≤0.05)。在金麗品種中，PpPSY在花苞和硬核果中的表達無顯著性差異(P>0.05)，但兩者均顯著高于花、葉芽和軟核果(P≤0.05)；PpPSY在花中的表達顯著高于葉芽和軟核果(P≤0.05)，但后兩者相互之間無顯著性差異(P>0.05)。在‘湖景’品種中，PpPSY在花苞、花、葉芽、軟核果和硬核果中的表達無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 PpPSY蛋白的三級結構預測Fig.4 The deduced tertiary structure of PpPSY protein

相同字母表示經Duncan氏新復極差法檢驗在0.05水平上差異不顯著。The same letter means non-significant difference at 0.05 levels by Duncan’s multi-test.圖5 PpPSY基因在桃果實不同發育組織中的相對表達量Fig.5 Relative expression of PpPSY gene in different developmental tissues of peach fruit

3 討論

近年來，對擬南芥種子[16]、薯塊莖[17]、玉米胚乳[18]、龍膽花瓣[19]、番茄果實[20]等的研究表明，PSY是類胡蘿卜素進行生物合成過程的重要限速酶。Shumskaya等[21]研究發現，植物體內相關等位基因可自發形成功能突變體，后者通過特定催化位點突變而使得PSY蛋白具有特異酶催化活性。本研究采用基因克隆技術獲得桃果實PpPSY基因全長cDNA序列，生物信息學分析結果顯示PpPSY蛋白二級構件中主要以α-螺旋和無規則卷曲為主，水溶性較好。李卿等[22]研究發現，蛋白質折疊結構的形成能使得蛋白質形成良好的親水表面以及疏水內核，這與本研究結果基本相符。功能分析顯示，PpPSY基因編碼的氨基酸序列上存在底物結合位點、Mg2+結合位點、活性位點殘基蓋、催化殘基、天冬氨酸富集區等結構域，這與麥秀英等[23-24]的研究結果完全一致，這些結構域共同形成了PSY特定酶催化功能。上述研究結果可望為后期深入研究提供研究思路和切入點。

PSY作為植物類胡蘿卜素生物合成途徑中的第一個限速酶，近年來越來越受研究學者的重視。研究發現，杏果實和柑橘果實中的PSY基因表達與類胡蘿卜素積累具有良好的正相關性[25-26]。PSY基因的正向表達誘導了枸杞花中類胡蘿卜素的生物合成積累并產生黃綠色花[27]。Paine等[28]通過基因工程技術，采用玉米PSY取代“黃金水稻”PSY，結果發現，“黃金水稻”中總類胡蘿卜素含量較之前增加了約23倍。通過調控木薯、番茄等植物PSY基因超量表達，結果發現，木薯根部、番茄果實中類胡蘿卜素各組分含量均有不同程度的增加[20，29]。由此可見，PSY基因是誘導植物類胡蘿卜素生物合成的主效基因之一。本研究通過對桃果實不同發育組織中PSY基因表達情況進行分析，結果顯示，在黃肉品種金麗中，PpPSY在花苞和硬核果中的表達較高，顯著高于在花、葉芽和軟核果中的表達；而在白肉品種湖景中，PpPSY在花苞、花、葉芽、軟核果和硬核果中的表達較低且相互之間均無顯著性差異。以上研究結果表明，PpPSY在金麗品種果實發育組織中的表達活性強于湖景品種。

PpPSY基因的成功克隆及生物信息學分析結果可為后續PpPSY蛋白功能鑒定、結構分析等實驗研究提供一定的理論依據。PpPSY基因在黃肉品種金麗發育組織中的表達高于白肉品種湖景，且在金麗品種中，PpPSY基因在花苞和硬核果中的表達顯著高于在花、葉芽和軟核果中的表達，數據分析結果可為后續進一步探明桃果實類胡蘿卜素生物合成分子機理提供數據參考。

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