肝內膽管細胞癌中E3泛素化連接酶UHRF2的表達及臨床意義

曾海英， 彭 睿， 黃曉勇， 張歆昱， 楊 軒， 陸佳成， 施國明， 柯愛武， 蔡加彬*

1. 復旦大學附屬中山醫院病理科，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所，上海 200032

肝內膽管細胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是上皮來源的惡性腫瘤，占原發性肝癌的4%～6%[1-2]。ICC發病隱匿、侵襲性高、易轉移，多數患者預后不良[3]。目前早期ICC可手術切除，但其早期診斷及輔助治療仍較困難[4]。因此，尋找ICC的早期診斷指標至關重要。

泛素化系統的調節異常與腫瘤、炎癥等多種疾病密切相關[5-6]。E3泛素化連接酶UHRF2與多種腫瘤相關。UHRF2與細胞周期蛋白相關，并由此影響非小細胞肺癌的增殖[7-9]。近期研究[10-14]發現，UHRF2與DNA甲基化和組蛋白甲基化有關。UHRF2在肺癌[15]、結腸癌[16]及膠質瘤[17]中的作用均有報道，但與ICC的關系尚不清楚。因此，本研究檢測了UHRF2在ICC患者癌組織中的表達，并評估其與ICC臨床病理因素的相關性及預后評估價值，為ICC患者臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源 選取2002年11月至2009年11月在復旦大學附屬中山醫院接受手術切除的138例ICC患者的癌組織石蠟切片。所有患者均有明確的病理診斷，并有完整的5年隨訪資料。本研究通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會審核批準。

1.2 免疫組化 組織芯片60℃烤片2 h，二甲苯脫蠟，分別用100%、95%、85%、75%乙醇水化。然后用甲醇過氧化氫溶液孵育30 min以消除內源性過氧化氫酶，高溫微波檸檬酸鈉溶液抗原修復15 min，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。加入UHRF2一抗 (博士德，1∶1 000)，于4℃孵育過夜后，用磷酸鹽緩沖液洗去一抗，用辣根過氧化物酶(HRP)室溫孵育1 h，DAB顯色，顯微鏡下觀察細胞質染色情況。染至深棕色用磷酸鹽緩沖液終止顯色，蘇木精復染30 s，水洗返藍10 min，然后用75%、85%、95%、無水乙醇逆濃度梯度脫水，二甲苯透明，風干，中性樹膠封片保存。

UHRF2組化染色評判標準：選擇UHRF2表達的中間值作為截斷值，以UHRF2陽性染色區域≥50%時為UHRF2高表達[18-19]。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計數資料以率(%)表示，組間比較采用卡方檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法；相關分析采用Cox回歸模型。檢驗標準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 UHRF2在ICC組織中的表達 138例患者中，67例(48.55%)癌組織中UHRF2高表達。結果(圖1)顯示：UHRF2主要表達于ICC細胞質中，且UHRF2在癌組織中的表達高于對應癌旁組織。

圖1 UHRF2在ICC及癌旁組織中表達

2.2 UHRF2表達與ICC患者臨床病理特征的關系 結果(表1)表明：UHRF2表達在不同甲胎蛋白(AFP)水平(P=0.010)、腫瘤分化程度(P=0.026)、淋巴結轉移情況(P=0.001)、TNM分期(P=0.019)ICC患者中差異均有統計學意義。

表1 UHRF2與患者臨床特征的關系 n

HBsAg：乙肝表面抗原；CA19-9：糖類抗原19-9；AFP：甲胎蛋白

2.3 UHRF2與ICC患者預后的關系 結果(圖2)表明：138例患者5年生存率為22.46%(31/138)，UHRF2高表達組(13.43%，9/67)低于低表達組(30.99%，22/71；P<0.001)；138例患者5年累計復發率為76.81%(106/138)，UHRF2高表達組(83.58%，56/67)高于UHRF2低表達組(70.42%，50/71；P<0.001)。

2.4 ICC患者預后因素分析 單因素分析(表2)顯示：腫瘤大小、腫瘤個數、腫瘤分化、淋巴結轉移、有無癌栓、TNM分期、UHRF2表達影響ICC患者的5年生存率和5年累計復發率(P<0.05)。多因素分析(表3)顯示：腫瘤大小、UHRF2表達是ICC患者5年生存率和累計復發率的獨立影響因素(P<0.05)。

圖2 UHRF2高低表達組ICC患者5年生存率與累計復發率的比較P<0.001

影響因素5年生存率HR(95%CI)P值5年累計復發率HR(95%CI)P值性別(男vs女)1.015(0.690～1.493)0.9390.962(0.654～1.414)0.962年齡(<53歲vs≥53歲)0.878(0.600～1.287)0.5060.826(0.563～1.210)0.326HBsAg(陰性vs陽性)0.952(0.645～1.405)0.8060.848(0.571～1.260)0.414CA19-9(<37vs≥37,ng/mL)0.848(0.570～1.261)0.4150.817(0.549～1.216)0.319AFP(<20vs≥20,ng/mL)0.703(0.399～1.238)0.2230.903(0.504～1.617)0.731周圍侵犯(有vs無)0.750(0.440～1.276)0.2890.677(0.397～1.154)0.151腫瘤大小(<5cmvs≥5cm)0.565(0.340～0.939)0.0280.491(0.291～0.826)0.007腫瘤個數(單個vs多個)0.415(0.220～0.781)0.0060.348(0.183～0.662)0.001腫瘤分化(高vs低)0.659(0.449～0.967)0.0330.647(0.440～0.950)0.026淋巴結轉移(有vs無)0.547(0.358～0.837)0.0050.496(0.326～0.755)0.001癌栓(有vs無)0.582(0.361～0.941)0.0270.578(0.357～0.934)0.025肝硬化(有vs無)0.842(0.572～1.239)0.3820.896(0.608～1.319)0.578TNM分期(Ⅰ～ⅡvsⅢ～Ⅳ)1.754(1.185～2.595)0.0051.920(1.300～2.836)0.001UHRF2表達(高vs低)2.207(1.494～3.261)0.000a1.976(1.340～2.914)0.001

HBsAg：乙肝表面抗原；CA19-9：糖類抗原19-9；AFP：甲胎蛋白

表3 ICC患者多因素Cox分析

3 討 論

作為UHRF家族蛋白成員，既往對于UHRF2的研究主要集中于表觀遺傳學方面，如DNA甲基化等[20-21]。研究發現，在腫瘤中，其可與周期相關蛋白[22]、p53[23]相互作用。UHRF2在腫瘤中的作用較為復雜，臨床意義目前也不明確。本研究發現，UHRF2在部分ICC患者中高表達，高表達者生存率低于低表達者、復發率高于低表達者，且UHRF2是ICC患者預后的獨立影響因素，提示UHRF2可用于預測ICC患者的生存和腫瘤復發。此外，本研究中，UHRF2與AFP水平、腫瘤分化、淋巴結轉移、TNM分期相關，提示UHRF2可能參與腫瘤的分化和轉移。

綜上所述，UHRF2表達與ICC腫瘤的惡性程度相關，高表達者預后較低表達者更差，可作為ICC預后指標用于臨床。今后將加大樣本量進一步分析其與ICC患者臨床指標的關系，并探討其作用機制。

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