C4d聯(lián)合外周血抗體對移植腎患者預后的預測價值

張 明, 顧 勇*, 陸福明, 瞿連喜, 何 軍, 袁曉妮

1. 復旦大學附屬華山醫(yī)院腎臟科，上海 200040 2. 復旦大學附屬華山醫(yī)院泌尿外科，上海 200040 3. 蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇省血液研究所，蘇州 215006

目前，診斷移植腎排異的金標準是移植腎病理檢查，目前國際上主要采用BANFF和CCTT標準。研究[1-2]顯示，C4d與外周血人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)抗體緊密相關(guān)，但C4d陽性而HLA抗體陰性或單獨HLA抗體陽性的患者預后如何目前仍無定論。部分腎移植排異患者中，其抗體非HLA抗體，而是其他抗體，如主要組織相容性復合體Ⅰ類相關(guān)鏈A (major histocompatibility complex class Ⅰ-related chain A，MⅠCA)抗體、血管緊張素受體抗體、內(nèi)皮細胞抗體等。這些抗體是通過補體激活途徑還是其他機制造成移植物損害，目前尚無定論。而這些抗體與C4d的關(guān)系如何及這些抗體與C4d均陽性對移植物腎功能是否有影響目前研究較少。

因此，本研究探討了腎移植患者中，HLA抗體及MⅠCA抗體與C4d及病理形態(tài)的關(guān)系，以及C4d在兩種抗體分別陽性時對移植腎功能的影響，以期更深入了解抗體介導的移植腎排異。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2004年1月至2007年12月于復旦大學附屬華山醫(yī)院首次腎移植的患者。入選標準：血肌酐值較移植后基線值升高20%或以上，病理診斷為急性或慢性排異，術(shù)前抗體檢測陰性，淋巴毒交叉配型實驗<10%，有長期隨訪資料。排除標準：因肝功能不全、感染、腸道吸收不良、對服用免疫抑制藥物不耐受或過敏等停用免疫抑制藥物者。合并用藥情況不限。共52例患者入選，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

52例患者中，男性36例，女性16例；移植時平均年齡為(40.6±8.0)歲。原發(fā)疾病包括慢性腎小球腎炎30例，梗阻性腎病2例，多囊腎1例，慢性腎盂腎炎3例，病因不詳16例。52例患者移植前替代治療時間平均為(12.0±9.8)個月。患者術(shù)后采用三聯(lián)免疫治療，MMF+CsA+潑尼松25例、MMF+FK506+潑尼松27例。

1.2 方 法 所有入選患者在移植腎病理活檢后采取外周血標本，分離血清后儲存于-20℃冰箱待測。移植腎標本C4d染色采用間接免疫熒光法。內(nèi)生肌酐清除率(GFR)采用CG公式，并計算每月GFR變化率：ΔGFR(%)=[(隨訪結(jié)束時GFR-隨訪開始時GFR)/隨訪開始時GFR/隨訪月數(shù)]×100。HLA抗體、MICA抗體采用免疫磁珠流式細胞儀液相芯片(Flow PRATM beads)檢測，由美國One Lambda公司提供LABScreen○ R試劑，按照操作說明測定；用Luminex液相芯片分析平臺及LABScreen○ R軟件對檢測結(jié)果進行分析。所有指標隨訪1年。

2 結(jié) 果

2.1 C4d與抗體的關(guān)系 C4d陽性者HLA抗體陽性率高于C4d陰性者(P<0.05)；C4d陽性者與陰性者MⅠCA抗體陽性率差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 C4d與抗體的相關(guān)性 n(%)

*P=0.003與C4d(+)HLA抗體(-)相比

2.2 C4d、HLA抗體、MⅠCA抗體與病理形態(tài)的關(guān)系 急性病變中，C4d陽性者腎小球炎患者比例高于C4d陰性者(P<0.05)；慢性病變中，C4d陽性者腎小球基底膜分層現(xiàn)象約高于C4d陰性者50%，但差異無統(tǒng)計學意義(表2)。急性病變中，HLA抗體陽性者血管炎患者比例高于HLA抗體陰性者(P<0.05)；慢性病變中，HLA抗體陽性者動脈內(nèi)膜增厚比例高于HLA抗體陰性者(P<0.05，表3)。MⅠCA陽性者與陰性者各病理形態(tài)患者比例差異無統(tǒng)計學意義(表4)。C4d、MⅠCA抗體均陽性或其中之一為陽性者病理類型與C4d、MⅠCA抗體均陰性者差異無統(tǒng)計學意義(表5)。

表2 C4d與病理形態(tài)的相關(guān)性 n(%)

表3 HLA抗體與病理形態(tài)的相關(guān)性 n(%)

表4 MⅠCA抗體與病理形態(tài)的相關(guān)性 n(%)

表5 C4d/MⅠCA抗體與病理類型的相關(guān)性 n(%)

CAN：慢性移植物腎病；ACR：急性細胞性排異；AMR：急性體液性排異

2.3 C4d、HLA抗體、MⅠCA抗體與GFR變化率的關(guān)系 C4d陽性者GFR下降[(-1.5±2.9)%]快于陰性者[(-0.65±2.4)%]，但差異無統(tǒng)計學意義。C4d、HLA抗體均陽性或其中之一為陽性者GFR下降快于C4d、HLA抗體均陰性者(P<0.05)；C4d、MⅠCA抗體均陽性或其中之一為陽性者GFR下降快于C4d、MⅠCA抗體均陰性者(P<0.05)；C4d伴隨外周血HLA或MⅠCA抗體陽性者較單獨C4d陽性者GFR下降更明顯(P<0.05，表6)。

表6 C4d聯(lián)合HLA抗體或MⅠCA抗體與GFR變化率的相關(guān)性

*P<0.05與C4d(-)/HLA抗體(-)者相比；△P<0.05與C4d(+)/HLA抗體(-)者相比；▲P<0.05與C4d(-)/MⅠCA抗體(-)者相比；▽P<0.05與C4d(+)/MⅠCA抗體(-)者相比

3 討 論

C4d是補體經(jīng)典激活途徑活化產(chǎn)物C4b的裂解片段。C4d與內(nèi)皮細胞緊密結(jié)合，因此可作為補體活化的標志。C4d在移植腎中沉積能獨立表明受者體內(nèi)發(fā)生了體液性同種異型反應(yīng)，與移植腎體液性排異反應(yīng)引起的各種組織病理學改變直接相關(guān)[1-4]，故C4d被認為是抗原抗體反應(yīng)的一個間接證據(jù)。由于補體由抗原抗體反應(yīng)所激發(fā)，因此本研究探討了C4d與HLA抗體、MⅠCA抗體的關(guān)系，以及三者對于移植腎功能的影響。

本研究腎移植患者中，C4d陽性者HLA抗體陽性率較C4d陰性者高，與以往研究[1-2]結(jié)論一致；但C4d陽性者MⅠCA抗體陽性率與C4d陰性者差異無統(tǒng)計意義，且MⅠCA抗體的存在與移植腎的病理類型的關(guān)系不明顯。Zou等[3]的研究中，腎移植后MⅠCA抗體和和補體C4d的激活相關(guān)；而Alvarez等的研究[4]發(fā)現(xiàn)MⅠCA抗體陽性率在C4d陽性組(21%)與C4d陰性組(7.7%)差異無統(tǒng)計學意義。Chaudhuri等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，腎移植患兒MⅠCA抗體陽性率為25%，且與急性體液性排異(AMR)和慢性體液性排異(CAMR)相關(guān)，但與C4d關(guān)系不明顯。該現(xiàn)象的原因可能為MⅠCA的抗原性弱于HLA，激發(fā)的補體反應(yīng)較弱，而傳統(tǒng)的C4d測定方法較難檢測出。Cai等[6]研究的975例腎移植患者中，44%患者因排異而腎臟失功，在這些患者血中檢測出與C1q結(jié)合的MⅠCA抗體或HLA抗體，但只有部分MⅠCA抗體陽性的患者C4d陽性。此外，部分患者MⅠCA抗體可能是非致病性的，滴度較弱，且非針對供者，故補體不易被激活，與排異反應(yīng)相關(guān)性不強。

本研究中，C4d陽性者腎小球炎患病率升高(P=0.023)；C4d陽性者血管炎比例大于C4d陰性者，但差異無統(tǒng)計學意義。腎小球炎和血管炎均是急性體液性排異的一種病理形態(tài)。 Mauiyyedi等[7]發(fā)現(xiàn)，C4d陽性者有55%出現(xiàn)腎小球中性粒細胞浸潤、20%出現(xiàn)腎小球壞死、25%出現(xiàn)血管炎，而C4d陰性者這些病變比例分別為4%、0、0。Nickeleit等[8]報道，C4d陽性者有57%出現(xiàn)腎小球炎、45%有血管炎表現(xiàn)。以往研究及本研究均反映了C4d和抗體介導的病理損害相關(guān)。本研究中，40%C4d陽性者出現(xiàn)基底膜分層，高于C4d陰性者(24%)，但差異無統(tǒng)計學意義。目前，多數(shù)學者認為，在慢性體液性排異中，C4d和移植物腎病有關(guān)，而移植物腎病的病理表現(xiàn)主要為腎小球基底膜分層。 Herman等[9]在20例慢性移植物腎病活檢標本中發(fā)現(xiàn)，50%有C4d陽性及移植物腎病改變。本研究中C4d陽性者和陰性者基底膜分層差異無統(tǒng)計學意義可能與樣本量較小有關(guān)。

本研究中，HLA抗體陽性在移植腎急性病變中主要與血管炎，慢性病變中主要與小動脈內(nèi)膜增厚相關(guān)。Alvarez-Márquez等[4]等發(fā)現(xiàn)，HLA-Ⅰ類抗體與血管內(nèi)膜炎、纖維素樣壞死有關(guān)。Sis等[10]報道，在慢性移植物腎病中，HLA-Ⅱ類抗體和移植物腎病有關(guān)。本研究雖然未區(qū)分HLA-Ⅰ類或Ⅱ類抗體，但發(fā)現(xiàn)HLA抗體與血管的急性和慢性病變相關(guān)。腎移植抗體的靶抗原主要在血管內(nèi)皮細胞上，因而易導致血管病變。

本研究中，MⅠCA抗體陽性率與間質(zhì)炎癥、腎小球炎、腎小球壞死等急性病變，以及小管萎縮、間質(zhì)纖維化等慢性表現(xiàn)差異均無統(tǒng)計學意義。因此推測在體液因素介導的排異中，可能以HLA抗體為主，MⅠCA抗體只在部分病例中起作用。而小樣本研究可能導致結(jié)果偏倚，因此還需進一步擴大樣本量證實MⅠCA抗體與病理形態(tài)的關(guān)系。

本研究還發(fā)現(xiàn)，單獨C4d陽性與C4d陰性者相比，GFR的變化不甚明顯。對于C4d和移植腎存活率的關(guān)系，有不少相反的報道。一項大型研究[11]將1 326次活檢納入分析，未發(fā)現(xiàn)C4d陽性與腎存活率的關(guān)系，但C4d陽性組患者免疫抑制強度較大，可能影響腎存活率。另有研究[12-13]認為，C4d陽性者腎臟存活率低。上述結(jié)論的差異可能與隨訪期有關(guān)，例如2007年一項研究[13-14]顯示，部分C4d陽性腎移植患者沒有病理學改變，但其長期轉(zhuǎn)歸沒有定論。另一方面，目前設(shè)計的臨床試驗缺乏免疫抑制用藥的隨機對照，且醫(yī)師會加強C4d陽性者的免疫抑制治療。因此，C4d陽性與腎存活率的關(guān)系還需要前瞻性的隨機對照試驗來證實。

本研究以GFR變化率這個較敏感的指標反映移植腎功能的變化，發(fā)現(xiàn)單獨C4d陽性與C4d陰性者GFR的變化不明顯，而C4d聯(lián)合HLA抗體或MⅠCA抗體陽性者GFR下降更明顯。C4d陽性聯(lián)合HLA、MⅠCA抗體陰性者GFR下降率不明顯，說明外周血抗體的存在對移植腎長期存活率的預測作用優(yōu)于單獨C4d陽性。文獻[15-16]報道，C4d陽性不僅在排異患者中出現(xiàn)，在程序性腎活檢、ABO血型不相容的移植中也出現(xiàn)。因此，對于移植腎的預后，外周血抗體的預測作用可能更可靠。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，對于急性移植腎排異患者，伴HLA或MⅠCA抗體陽性較單獨C4d陽性對移植腎的預后更有預測價值。然而，本研究為單中心小樣本研究，且隨訪期較短，另外由于供體血標本未保存而無法檢測供者特異性抗體(donor specific antibody，DSA)。因此，本研究存在一定的局限性，今后將擴大樣本量，并對患者進行分層研究，以驗證本研究結(jié)論。

[ 1 ] SERINS?Z E, BOCK O, GWINNER W, et al. Local complement C3 expression is upregulated in humoral and cellular rejection of renal allografts[J]. Am J Transplant, 2005, 5(6): 1490-1494.

[ 2 ] MENGEL M, BOGERS J, BOSMANS J L, et al. Incidence of C4d stain in protocol biopsies from renal allografts: results from a multicenter trial[J] . Am J Transplant, 2005, 5(5): 1050-1060.

[ 3 ] ZOU Y, HEINEMANN F M, GROSSE-WILDE H, et al. Detection of anti-MICA antibodies in patients awaiting kidney transplantation, during the post-transplant course, and in eluates from rejected kidney allografts by Luminex flow cytometry[J]. Hum Immunol,2006, 67(3):230-237.

[ 5 ] CHAUDHURI A, OZAWA M, EVERLY M J, et al. The clinical impact of humoral immunity in pediatric renal transplantation[J]. J Am Soc Nephrol, 2013, 24(4): 655-664.

[ 6 ] CAI J, TERASAKI P I, ZHU D, et al. Complement-fixing antibodies against denatured HLA and MⅠCA antigens are associated with antibody mediated rejection[J]. Exp Mol Pathol, 2016, 100(1): 45-50.

[ 7 ] MAUIYYEDI S, COLVIN R B. Humoral rejection in kidney transplantation: new concepts in diagnosis and treatment[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens,2002,11(6):609-618.

[ 8 ] NICKELEIT V, ZEILER M, GUDAT F, et al. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications[J]. J Am Soc Nephro, 2002. 13(1):242-251.

[ 9 ] HERMAN J, LERUT E, VAN DAMME-LOMBAERTS R, et al. Capillary deposition of complement C4d and C3d in pediatric renal allograft biopsies[J]. Transplantation, 2005, 79(10): 1435-1440.

[10] SIS B, CAMPBELL P M, MUELLER T, et al. Transplant glomerulopathy, late antibody-mediated rejection and the ABCD tetrad in kidney allograft biopsies for cause[J]. Am J Transplant, 2007, 7(7):1743-1752.

[11] SIS B, BAGNASCO S M, CORNELL L D, et al. Isolated endarteritis and kidney transplant survival: a multicenter collaborative study[J]. J Am Soc Nephrol,2015, 26(5):1216-1227.

[12] HAAS M, MIROCHA J, REINSMOEN N L,et al. Differences in pathologic features and graft outcomes in antibody-mediated rejection of renal allografts due to persistent/recurrent versus de novo donor-specific antibodies[J]. Kidney Int, 2017, 91(3):729-737.

[13] HOGEN R, DINORCIA J, DHANIREDDY K. Antibody-mediated rejection: what is the clinical relevance? [J]. Curr Opin Organ Transplant, 2017, 22(2):97-104.

[14] KIBERD B A, MILLER A, MARTIN S, et al. De novo donor-specific human leukocyte antigen antibody screening in kidney transplant recipients after the first year post-transplantation: a medical decision analysis[J]. Am J Transplant, 2016 ,16(11):3212-3219.

[15] MA J, PATEL A, TINCKAM K. Donor-specific antibody monitoring: where is the beef? [J]. Adv Chronic Kidney Dis, 2016, 23(5):317-325.

[16] RAY D S, THUKRAL S. Outcome of ABO-incompatible living donor renal transplantations: a single-center experience from Eastern India [J]. Transplant Proc, 2016, 48(8):2622-2628.