震蕩法在糾正EDTA依賴的假性血小板減少中的應用

羅 磊， 朱建鋒， 王蓓麗， 郭 瑋， 潘柏申

復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032

EDTA依賴的假性血小板減少(EDTA-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP)是一種由EDTA鹽抗凝劑引起血小板聚集，導致血細胞自動分析儀不能有效識別，從而產生血小板計數結果明顯低于正常值的現象[1]。EDTA-PTCP在門診患者中發生率為0.09%～0.11%[2]，住院患者中約1.9%[3]。目前，檢驗科針對EDTA-PTCP的患者通常采用更換枸櫞酸鈉抗凝劑、添加氨基糖苷類藥物或人工血小板計數的方法來進行復檢。然而，這些方法比較耗時、費力，且更換抗凝劑和人工計數需要重復抽血，給患者造成了一定的痛苦。因此，本研究嘗試采用更為簡便的震蕩法來解散EDTA引起的血小板聚集團簇，糾正EDTA-PTCP，以期獲得可靠的血小板計數結果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年3月至2016年1月EDTA-PTCP患者140例。其中，男性68例，女性72例；年齡31～68歲，中位年齡為53歲。入組標準：血常規檢測中僅血小板計數減少(<125×109/L)，其他參數均正常；儀器有報警提示血小板聚集，血涂片鏡檢確認存在聚集現象；更換枸櫞酸鈉抗凝劑能糾正?；颊咂つw無紫癜，黏膜無出血，肝、脾、淋巴結未見腫大，除外其他引起血小板減少的疾病[4]。另隨機選擇20例血常規結果完全正常的標本作為對照。

1.2 儀器與材料 采用Sysmex XE-2100全自動血液分析儀及IKA○ RMS3圓周式震蕩儀；Sysmex XE-2100全自動血液分析儀配套試劑、BD公司EDTA-K2及枸櫞酸鈉抗凝劑真空采血管；Sysmex XE-2100配套質控e-CHECKTM。

1.3 檢測方法 EDTA-PTCP血標本及正常血標本用高速震蕩儀以3 000 r/min(r=4.5 mm)震蕩3 min后，立刻于Sysmex XE-2100全自動血液分析儀上再次檢測，并制作血涂片2張用于顯微鏡下觀察血小板分布情況。顯微鏡下觀察時采用400倍高倍鏡(物鏡40倍×10倍目鏡)，瀏覽血涂片尾部、雙側及血細胞分布均勻區域，至少觀察10個視野，比較震蕩前后血小板計數、紅細胞計數、白細胞計數結果及血涂片中血小板分布情況。以鏡檢血小板分布情況作為判斷血小板聚集是否解散的標準。所有標本在采集后30 min內完成首次檢測，震蕩后再次檢測均在標本采集當天完成。

2 結 果

2.1 震蕩前后血小板計數及聚集情況比較 140例EDTA-PTCP血標本震蕩前后，血小板計數分別為(6～118)× 109/L、(13～376)× 109/L，中位數分別為 47× 109/L、162× 109/L。震蕩法后鏡檢提示，93例完全解聚(圖1、圖2)、47例未完全解聚。

93例完全解聚標本震蕩前后血小板計數差異有統計學意義(P<0.05)；47例未完全解聚標本震蕩前后血小板計數差異無統計學意義(表1)。

圖1 93例震蕩后解聚EDTA-PTCP標本震蕩前后血小板計數情況對比

圖2 震蕩后解聚EDTA-PTCP標本震蕩前(A)、后(B)血涂片中血小板分布比較

標本數血小板計數(×109/L)范圍中位數完全解聚(n=93) 震蕩前6～11833 震蕩后128～376184未完全解聚(n=47) 震蕩前8～9039 震蕩后13～14548

2.2 震蕩前后紅細胞計數、白細胞計數比較 140例EDTA-PTCP血標本震蕩前后紅細胞計數分別為(4.62 ± 0.41)× 1012/L、(4.70 ± 0.44)× 1012/L，白細胞計數分別為(6.49 ± 1.64)× 109/L、(6.56 ± 1.68)× 109/L，差異均無統計學意義。

2.3 正常血標本震蕩前后比較 20例正常的血常規標本震蕩前后血小板計數、紅細胞計數、白細胞計數及血小板參數差異均無統計學意義。

表2 正常血標本震蕩前后參數結果比較

PLT: 血小板計數；RBC：紅細胞計數：WBC：白細胞計數；MPV：平均血小板體積；PDW：血小板分布寬度；PCT：血小板比積

3 討 論

EDTA-K2抗凝劑是引起假性血小板計數降低的主要原因之一[5]，已經引起了檢驗科的高度重視。全自動血細胞分析儀以其快速、簡便、精密度好和準確性高的優點被臨床實驗室廣泛用于血液細胞計數分析。然而，由于血小板計數分析原理(阻抗法)的局限性，當血小板發生聚集時，體積遠大于正常血小板，血細胞分析儀將其誤認為白細胞計數，導致血小板計數結果假性降低，如不進行鏡檢確認和糾正，可能導致臨床誤診，使患者接受不必要且有創性治療，如輸注血小板、按照免疫性血小板減少癥進行激素治療或進行骨髓穿刺術。

目前，檢驗科在遇到EDTA-PTCP患者時，通常采取的措施是重新采集經枸櫞酸鈉抗凝的血液標本進行檢測或添加氨基糖苷類藥物進行解聚。枸櫞酸鈉抗凝標本檢測結果需要進行抗凝劑/血液標本體積校正。有文獻[6]報道，枸櫞酸鈉抗凝血小板的穩定性隨時間延長而降低，少數情況下使血小板發生聚集，造成假性血小板降低。而且重復采血不僅造成人力與時間的浪費，還會給患者帶來痛苦。而添加氨基糖苷類藥物后，血小板聚集解離需要約30 min。而且，不同患者對氨基糖苷類藥物的敏感性不同，解聚效果不盡相同[7]，加之氨基糖苷類藥物會導致白細胞分類檢測通道溶血及染料結合效果不佳，從而導致分類計數結果不準確。

本研究嘗試在避免重復抽血的基礎上，采用震蕩法快速處理EDTA-PTCP標本，對該方法用于糾正EDTA-PTCP的可行性進行了探討。結果顯示，93例(66.4%)標本完全解聚，提示震蕩法能代替枸櫞酸鈉抗凝法用于EDTA-PTCP標本解聚。震蕩法一定程度上減少了因重復抽血造成的人力與時間浪費以及給患者帶來的痛苦，避免了臨床上因誤診血小板減少而進行血小板輸注等的發生。

本研究中，有47例(33.6%)EDTA-PTCP標本，震蕩法無法將其聚集的血小板完全解散，可能與EDTA-PTCP的發生機制有關。目前，對于EDTA-PTCP的機制尚未明確，通常認為是一種免疫機制介導的現象，即體外血液中EDTA依賴性血小板自身抗體誘導血小板聚集。最早Pegels等[8]發現，血小板無力癥(Glanzmann病)無此現象發生，因該病患者血小板膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa基因缺失，從而推測EDTA依賴性血小板自身抗體作用位點可能是GPⅡb/GPⅢa。研究[9]發現，發生EDTA-PTCP時，這種自身抗體主要作用于血GPⅡb。GPⅡb是一個Ca2+依賴蛋白質，在Ca2+存在時與GPⅢa 組成異源二聚體；當Ca2+濃度降低時，GPⅡb/Ⅲa二聚體解離，顯露出GPⅡb上的隱性表位。EDTA依賴性血小板自身抗體可能通過作用于這一隱性表位而引起血小板聚集。但部分情況下結合不牢固，可通過震蕩分散解離；對于無法震蕩解離的標本，自身抗體可能介導了血小板的進一步活化并促進纖維蛋白的形成，進而促進聚集[10]。

綜上所述，本研究證實，震蕩法可使大部分EDTA-PTCP血標本血小板解聚，有助于獲得準確的血小板計數結果，同時不影響其他血細胞參數，是一種簡單、有效的方法。而對于震蕩法無法糾正的標本，可再采取更換抗凝劑或添加氨基糖苷類藥物等方法進行解聚。

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