足細胞自噬在腎小球疾病中的研究進展

凌春燕 綜述，王 琳 審校

(上海中醫藥大學附屬龍華醫院腎病科 200032)

自噬是真核細胞內溶酶體依賴性蛋白降解的過程，自噬在饑餓、缺氧、缺血/再灌注、感染等條件下可以被激活，以維持細胞內環境穩定，調節能量代謝。足細胞是腎小球濾過屏障的主要成分，其結構和功能的完整性決定著腎小球濾過功能的完整性。因足細胞是高度分化的終末期細胞，當其丟失超過40%時，球囊粘連明顯增加，導致腎小球硬化增加，產生持續大量蛋白尿，乃至腎功能異常[1]。各種病理改變導致足細胞受損會使其從腎小球基底膜(GBM)脫落，造成濾過屏障完整性受損，最終導致蛋白尿產生。本文就足細胞在生理和病理情況下，自噬對其的作用及在腎臟疾病中發揮何種效應進行綜述。

1 細胞自噬(autophagy)

細胞自噬依據其分子機制、溶酶體攝入底物的方式等不同分為巨自噬、小自噬和分子伴侶介導自噬，目前通常說的“自噬”是指巨自噬，細胞自噬主要分為以下步驟：細胞接受自噬誘導信號，在細胞質某處形成吞噬泡(phagophores)；吞噬泡不斷延伸，將細胞質中的任何成分包括細胞器全部納入，形成密封的、球形自噬體(autophagosome)；自噬體形成后與溶酶體融合形成自體溶酶體(autolysosome)；自噬體的內膜被降解，二者的內容物合為一體，自噬體中的“貨物”被降解，產生氨基酸、脂肪酸等被輸送到細胞質中，供細胞重新利用[2]。

2 自噬相關信號通路

2.1哺乳動物雷帕霉素蛋白靶蛋白(mTOR)相關信號通路 mTOR是細胞生長調節的關鍵，mTOR激活抑制細胞自噬的發生。細胞中缺乏營養物質(如生長因子或氨基酸等)時，可通過抑制mTOR的表達，其后不僅可以激活Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(Class Ⅲ PI3K)和UNC-51樣激酶1(ULK1)，還可以抑制核糖體蛋白亞基6激酶(S6K1)活性，激活細胞自噬[3]。mTORC1(與自噬相關)活性受到細胞對氨基酸攝入水平的影響，受尿苷三磷酸酶(GTPases)和有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)3介導[4]。細胞在缺乏能量時ATP/AMP比值降低，細胞會啟動依賴AMP活化蛋白激酶(AMPK)的自噬過程來獲得能量[5]。

2.2PI3K/蛋白質激酶B(AKT)信號通路 PI3K是真核生物體內重要的信號分子。20世紀80年代，發現Ⅲ型PI3K分子抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)能抑制自噬[6]。AKT是PI3K/AKT信號通路的核心。正常生理條件下，絡氨酸激酶受體被細胞外及細胞內因子活化，進而激活PI3K，活化的PI3K將底物磷脂酰肌醇2磷酸(PIP2)轉化為磷脂酰肌醇3磷酸(PIP3)，使PIP3與磷酸肌醇依賴的激酶-1(PDK-1)協同完全激活AKT，繼而信號傳至mTOR，活化后的mTOR激活下游相關因子，抑制細胞自噬[7]。

2.3活性氧(ROS)信號通路 研究發現ROS參與細胞自噬的發生[8]。神經生長因子(NGF)缺陷時，大量ROS在線粒體蓄積，引起線粒體膜脂質過氧化，導致線粒體功能異常，進而激活自噬。ROS還可上調Atg4產生Atg8-磷脂酰胺(PE)復合體，促進復合體在細胞內累積，最終促進細胞自噬[5]。

2.4c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路 JNK是一種p54微管相關蛋白激酶，主要通過以下機制調節自噬：(1)通過磷酸化Bcl-2/Bcl-XL解離Beclin-1-Bcl-2/Bcl-XL復合體釋放Beclin-1；(2)通過介導Bcl-2的磷酸化阻礙Bcl-2/Bcl-XL與Beclin-1形成復合體[9]。

3 足細胞自噬及其在慢性腎臟病中的作用

有研究發現腎臟中的足細胞內自噬水平比其他細胞高，足細胞依賴自噬反應維持自身內環境的穩定[10]。有基礎研究檢測到正常足細胞內存在自噬泡，氯喹通過時間依賴方式增加自噬標志蛋白——微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)Ⅱ型的表達，說明足細胞自噬的高活性；該研究通過內毒素(LPS)誘導足細胞損傷，降低足細胞podocin、LC3Ⅱ和Beclin-1表達，使自噬體數量減少；而雷帕霉素(RAPA)可逆轉LC3Ⅱ和podocin低表達，3-MA可加重LPS的損傷作用[11]。HARTLEBEN等[12]通過觀察特異性敲除足細胞內ATG5基因的小鼠，發現小鼠足細胞喪失自噬能力后增加了其患腎病的風險，表明細胞自噬不僅能在正常情況下維持足細胞的自穩狀態，而且也是應激條件下足細胞內自我保護的有效機制。

3.1糖尿病腎病(DN)中足細胞自噬情況 DN小鼠腎小球中發現足細胞和自噬體數量明顯減少、LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯下降，腹腔注射RAPA后，LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，自噬功能恢復，蛋白尿減少[13]。高糖誘導足細胞損傷，在高糖作用72 h時足細胞損傷加重，細胞活性受抑制，自噬功能受抑制。p62/SQSM1基因敲除后，能明顯改善足細胞受損情況，緩解胰島素抵抗，說明足細胞自噬功能受抑制可能參與了DN的發病機制[14]。AUDZEYENKA等[15]研究發現，高糖誘導足細胞自噬水平下調，可能與其對胰島素敏感性降低有關。DN患者常存在脂質代謝紊亂，棕櫚酸(PA)能明顯增加足細胞中ROS產生，降低足細胞線粒體膜電位，增加足細胞凋亡，氯喹干預加重足細胞的凋亡，RAPA能有效抑制棕櫚酸誘導的ROS增多及細胞凋亡[16]。HUANG等[17]用高糖誘導人足細胞損傷，發現中藥三七提取物——三七皂苷R1能通過激活PI3K/AKT/mTOR通路恢復足細胞自噬功能，從而減少足細胞凋亡。上述研究表明，DN中存在足細胞自噬低表達情況，但具體分子機制尚不明確，可能與PI3K/AKT/mTOR信號通路有關[18]，也可能與腎臟衰老、氧化應激和內質網應激(ERS)及胰島素抵抗有關[14-15,19]，改善足細胞自噬功能可能是延緩DN進展新的治療靶點。

3.2IgA腎病(IgAN)中足細胞自噬情況 有研究發現，IgAN患者腎組織中足細胞自噬體的數量明顯減少[20]，該研究納入了35例病理確診為IgAN的患者，病理分期都在LeeⅡ級以上，透過光鏡和透射電鏡觀察足細胞結構和自噬體的變化。結果發現，與對照組相比，IgAN患者的足細胞自噬體明顯減少，且隨病理分期級別的增加，其自噬體的數量呈現上升趨勢，LeeⅣ級的患者腎組織中足細胞自噬體明顯較LeeⅡ級患者增多。LIANG等[21]進一步從IgAN患者和健康者血清中分離出IgA1用來體外培養小鼠系膜細胞48 h，制備IgA1-系膜細胞上清液，用該上清液培養小鼠足細胞(MPC5)。結果發現用IgAN患者IgA1-系膜細胞上清液培養的足細胞，其表達LC3 Ⅱ和CD63較健康者降低，p62蛋白累積，電子顯微鏡顯示其比健康者IgA1-系膜細胞上清液干預的足細胞自噬體明顯減少，凋亡蛋白caspase-3表達增加，足細胞凋亡增加。運用RAPA與IgA1-系膜細胞上清液共培養足細胞，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加30%，p62蛋白積累下降近50%，每個足細胞自噬體數量增加到單純用IgA1-細胞細胞上清液干預的近7倍，凋亡率也從19.88%下降到16.78%，caspase-3蛋白表達降低。RAPA作為mTOR信號通路的抑制劑，自噬通路的激活劑，能通過上調足細胞自噬功能起到保護IgAN患者足細胞的作用，為IgAN的治療提供了新靶點。

3.3膜性腎病(MN)中足細胞自噬情況 足細胞自噬功能異常同樣參與了MN的發病機制。LIANG等[22]通過35例IgAN和26例特發性MN(IMN)患者足細胞自噬體的電鏡檢測，發現腎病患者足細胞自噬體數量都明顯少于健康對照組(0～5個自噬體/足細胞)，兩種腎病類型之間自噬體數量無差異。根據患者腎小球濾過率(eGFR)情況，分為eGFR≥60 mL/min和eGFR<60 mL/min兩組，eGFR低的自噬體數比eGFR高的多。JIN等[23]研究納入15例健康者、41例MN患者包括26例IMN(Ⅰ期14例、Ⅱ期12例)和15例繼發性膜性腎病(SMN)，結果提示MN發病機制中可能存在足細胞自噬體減少的情況，這一現象隨著病理分期從Ⅰ期到Ⅱ期呈現加重趨勢。呂倩影等[24]通過亞溶破C5b-9誘導足細胞損傷，結果表明抑制自噬可以明顯加重C5b-9誘導的足細胞形態異常，包括nephrin表達的進一步減少和分布異常，并且增加足細胞的凋亡。

早期動物實驗發現，IMN經典被動Heyamnn腎炎大鼠發病機制中同時存在ERS激活和足細胞自噬功能活化現象，造模第14、21天，免疫組織化學結果顯示與對照組相比，LC3沿著腎小球毛細血管袢高表達，并隨著時間的增加，其表達逐漸增多[25]。非折疊蛋白反應誘導劑(UPR)——衣霉素2.5 ng/mL干預MPC5 10 h，誘導ERS活化，自噬增強，細胞骨架圍微管蛋白Tubulin表達降低、排列紊亂。加用PI3K阻斷劑與衣霉素共同干預足細胞后，與衣霉素組相比，LC3 Ⅱ表達明顯降低，Tubulin蛋白表達上升。說明在體內外實驗中均存在ERS激活，造成足細胞損傷(未凋亡)，自噬功能可改善ERS造成的足細胞損傷。體內外研究發現，與在人類腎組織中的表現并不完全相同，可能是因為動物并不能完全替代人類IMN的發病機制，但足細胞自噬功能的調節確實能起保護足細胞的作用，具體表現可能是早期的自噬激活，進行細胞自身的修復，晚期隨著疾病的進展，各種病理表現的加重，足細胞自噬功能受到抑制，自我修復自救能力降低，造成足細胞損傷的不可挽救，病情持續快速進展，跟臨床表現的腎病終末期進展加快相吻合。

3.4狼瘡性腎炎(LN)中足細胞自噬情況 在LN患者中，足細胞自噬功能異常存在于LN發病機制中。JIN等[23]納入了60例LN患者，病理分級從Ⅱ～Ⅴ型，LN患者足細胞自噬體數量明顯少于對照組，根據病理分級的加重，自噬體數量呈增多趨勢，但各型間差異無統計學意義(P>0.05)，同時研究還觀察到Ⅴ型LN患者(15例)足細胞內自噬體數量少于IMN組(26例)。SMN常繼發于LN，屬于自身免疫系統疾病，免疫功能的紊亂可能參與足細胞自噬體的形成，在IMN及LN發病機制中的致病作用可得到側面體現。

3.5抗腎小球基底膜性腎炎(anti-GBM) anti-GBM系循環中抗基底膜抗體介導的自身免疫性疾病，單有腎臟損傷時稱為anti-GBM。鈣依賴性磷脂酶A2γ(iPLA2γ)屬于磷脂酶A2受體家族，對補體介導的腎小球上皮細胞損傷時起保護作用。iPLA2γ基因敲除的小鼠并無蛋白尿的產生，但會導致線粒體結構異常，增加衰老足細胞的自體吞噬能力；有研究發現，iPLA2γ基因敲除幼鼠誘導anti-GBM后，與野生型相比，產生了明顯的蛋白尿、足細胞足突融合和足細胞脫落。從兩組小鼠中分離足細胞進行免疫印跡分析，iPLA2γ基因敲除小鼠足細胞骨架蛋白synaptopodin、Nephrin和podocalyxin表達均降低，足細胞骨架遭到破壞，足突間距拉大，LC3Ⅱ/Ⅰ比值明顯增加，同時AMPK磷酸化水平明顯較野生型增多[26]。iPLA2γ基因在正常足細胞及腎小球腎炎中起保護作用，其作用機制可能是通過調節自噬通路實現。

4 展 望

細胞自噬是一個相對復雜的過程，其在生理和病理上具有重要作用，以往的研究證實眾多介質和信號通路參與其中，包括Beclin-1和2、ClassⅢ、PI3K/AKT、mTOR、AMPK、JNK、ROS等。目前的研究表明足細胞可以通過細胞自噬功能清除細胞內的損傷和衰老的細胞器，維持內環境的穩定，防止自身的損傷引起腎臟疾病。這些相關研究主要觀察了足細胞自噬情況變化，了解其自噬能力丟失帶來的影響，雖然證明了細胞自噬與足細胞損傷的相關性，但并不能闡明之間的確切因果關系。細胞自噬參與足細胞損傷導致的腎病蛋白尿和腎小球硬化中的具體作用機制，仍有待進一步深入研究。