角質細胞生長因子-2對右旋葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎和腸道黏膜屏障的保護作用

(1復旦大學附屬中山醫院消化科, 2呼吸科 上海 200032)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種病因不明的腸道慢性非特異性炎癥性疾病,主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)。IBD病程漫長,常反復發作,缺乏長期有效的根治措施。盡管IBD的病因尚未完全明確,但研究表明腸道黏膜屏障功能障礙在IBD發病中起重要作用[1]。腸道黏膜是一道重要的機械屏障,阻止有害物質和有害微生物進入腸道組織并激活免疫反應[2]。而腸道黏膜屏障功能障礙和腸道炎癥互為因果,腸道炎癥可引起腸道屏障功能障礙,因此IBD患者往往腸道滲透性增加,而腸道黏膜屏障功能障礙也可能是IBD病情發作和復發的主要因素[3]。因此,修復腸道黏膜功能是IBD治療的重要目標之一。角質細胞生長因子-2(keratinocyte growth factor 2,KGF-2)問世以來已被用于許多上皮損傷疾病的臨床研究,如靜脈潰瘍、角膜擦傷、急性肺損傷等[4]。我們推測,KGF-2能夠促進上皮細胞增殖從而保護腸道屏障,有望成為IBD的潛在治療藥物。

KGF家族是成纖維生長因子家族 (fibroblast growth factors,FGFs)的亞族,其主要功能是作為旁分泌因子調控上皮細胞增殖、分化、遷移,與上皮組織的生長和修復密切相關。KGF-2是該家族的成員,主要由基質細胞表達和分泌,又稱為FGF-10。KGF-2釋放后與上皮組織中特異性表達的受體FGFR2b和FGFR1b結合,主要作為旁分泌因子促進上皮細胞增殖分化、生成血管和維持毛細血管的分子屏障功能[5]。既往研究證實KGF-2對DSS誘導的小鼠結腸炎的保護作用。Miceli等[6]的研究結果顯示KGF-2可以降低體重減輕、糞便評分和病理評分,其作用具有劑量依賴性,腹腔注射用藥最小起效濃度為1～3 mg/kg。Greenwood-Van等[7]的研究則顯示5 mg/kg腹腔注射的KGF-2可以重建和修復被炎癥破壞的電子轉運。KGF-2對DSS誘導的小鼠結腸炎腸道黏膜屏障的保護作用及其機制尚待進一步研究。

本研究的目的是:(1)證實KGF-2對DSS誘導的小鼠結腸炎具有減輕炎癥和保護腸道黏膜屏障的作用;(2)探究KGF-2對腸道組織中緊密連接蛋白的保護作用;(3)探討KGF-2對DSS誘導的小鼠結腸炎腸道組織中炎癥相關細胞因子TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β1、IL-1β、IFN-γ的作用。從而證實KGF-2的臨床應用價值,為臨床IBD的研究和疾病的預防和治療提供新思路。

材 料 和 方 法

試劑KGF-2試劑由上海新生源醫藥集團有限公司提供,溶于PBS緩沖液配成注射溶液。DSS購于美國MP Biomedicals公司,加雙蒸水配置為3.5%溶液。FITC-D購于美國Sigma公司,使用前用雙蒸水配置成3.5%溶液。小鼠TNF-α、IFN-γ ELISA試劑盒購于美國BioLegend公司,IL-6、IL-10、TGF-β1、IL-1β ELISA試劑盒購于美國eBioscience公司,ZO-1抗體購于美國Santa Cruz公司,occludin抗體購于美國Invitrogen公司,其余試劑為國產分析純。

實驗動物SPF級雄性C57BL/c小鼠36只,體重(22±3)g,購于上海萬樣醫用實驗動物飼養廠。實驗前飼養6天,按隨機數字表法分為4組。

實驗造模和特異性給藥36只小鼠均分4組:正常對照組(Control)、DSS模型組(Model)、中劑量KGF-2組[Model+KGF-2(5 mg/kg)]、高劑量KGF-2組[Model+KGF-2 (10 mg/kg)]。正常對照組飲用自來水,其余飲用雙蒸水配置的3.5%DSS溶液,DSS溶液3天更換1次。KGF-2給藥與造模同時進行,給藥形式為腹腔注射,正常對照組和DSS模型組注射等量PBS溶劑。

動物行為學檢測實驗過程中觀察小鼠一般情況,如進食、飲水和活動情況等,從第1天開始每天記錄小鼠的體重、糞便隱血或出血情況、糞便性狀,并進行疾病活動指數(disease activity index,DAI)評分[8](表1)。造模成功的標準為實驗過程中小鼠DAI較0天時的DAI上升,即觀察到體重減輕、糞便隱血或便血、糞便形狀改變等結腸炎臨床表現。

處死取材第7天時,每組各取3只小鼠予以FITC-D灌胃,4 h后心臟取血,離心取血清,用多功能酶標儀檢測FITC-D濃度。每組其余6只小鼠處死,量取結腸長度,取結腸組織留備HE染色和免疫組化染色、勻漿ELISA檢測和Western blot檢測。HE染色標本根據Cooper HS標準[8](表2)進行病理組織學評分。

表1 DAI 評分標準Tab 1 Standard of DAI

表2 病理評分標準Tab 2 Standard of histological evaluation

Final score=(I+E+C)×P.

免疫組化染色運用免疫組化法檢測各組小鼠結腸組織中ZO-1和occludin蛋白的表達。將組織塊用石蠟包埋、切片,經過烤片、脫蠟、暴露抗原位點、滅活過氧化物酶、血清封閉后,加對應的抗體孵育并顯色。使用Image Pro Plus v6.0軟件定量。

Westernblot檢測運用Western blot方法檢測各組小鼠結腸組織中ZO-1和occludin蛋白的表達。將結腸組織細胞裂解,提取組織蛋白、定量和分離,轉膜后分別與對應抗體孵育并顯色。使用Image Pro Plus V6.0軟件定量。

ELISA檢測運用ELISA方法檢測小鼠組織勻漿中TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-1β、IL-1β、IFN-γ的表達,分別按照各ELISA試劑盒說明書進行檢測。

統計學處理所測數據用SPSS 22.0進行One-way ANOVA方法檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

體重變化與DAI第4天,DSS模型組小鼠體重開始出現明顯下降、血便、活動度降低。第7天結腸病理組織活檢可見腸壁被炎性細胞浸潤,腸壁壞死較嚴重,黏膜糜爛,大量腺體脫落,杯狀細胞破壞。

DSS模型組的體重變化的百分比與正常對照組(P=0.013 2)、中劑量KGF-2組(P=0.013 3)和高劑量KGF-2組(P=0.017 6)之間的差異均有統計學意義。KGF-2組的體重下降程度明顯減弱(圖1A)。飲用DSS溶液后,DSS模型組、中劑量KGF-2組、高劑量KGF-2組的DAI均較0天時有不同程度的上升,以DSS模型組最為明顯(圖1B)。DSS模型組的DAI與正常對照組(P=0.004 8)、中劑量KGF-2組(P=0.017 2)和高劑量KGF-2組(P=0.021 1)相比差異均有統計學意義(圖1B)。

結腸長度正常對照組、DSS模型組、中劑量KGF-2組及高劑量KGF-2的結腸長度分別為(6.922±0.117 6)cm、(4.956±0.258 3)cm、(5.750±0.125 8)cm和(6.289±0.215 7)cm。與正常對照組相比,DSS模型組的結腸長度縮短明顯(P<0.000 1);與DSS模型組相比,中劑量KGF-2組(P=0.010 9)和高劑量KGF-2組(P=0.001 1)的結腸長度均明顯增加(圖1C)。

圖1KGF-2對DSS誘導的小鼠結腸炎的治療作用
Fig1EffectofKGF-2onDSS-inducedmurinecolitis

病理改變與正常對照組相比,DSS模型組結腸病理標本鏡下可見大量炎癥細胞浸潤,病變穿透黏膜全層,隱窩大面積破壞,表面上皮消失。2個KGF-2組與DSS模型組相比,炎癥浸潤程度相對減輕,隱窩結構相對完整,病變深度局限,病變范圍較小(圖2)。根據Cooper HS標準[8]對4組分別進行組織學評分,與正常對照組(2.500±0.223 6)比較,DSS模型組(20.00±1.844)的病理組織評分顯著升高(P<0.000 1);而與DSS模型組比較,中劑量組(12.33±1.202,P=0.005 9)和高劑量組(9.333±1.476,P=0.0011)病理評分均顯著下降(圖1D)。

Colonic HE staining in Controls (A),Model (B),Model+KGF-2 (5 mg/kg) (C) and Model+KGF-2 (10 mg/kg) (D).No inflammation infiltrate was appreciated.The crypts were straight with the base of the crypt sitting on the muscular mucosa in A.There was shortening of the crypts and focal thinning of the epithelium.The lamina propria and submucosa showed an inflammatory infiltrate in B.In C and D,the inflammatory infiltration and structure damage was slighter than in B.

圖2小鼠結腸組織HE染色(100×)
Fig2ColonicHEstainingofrats(100×)

FITC-D滲透率4組的FTIC-D滲透率(×10-4):正常對照組為12.80±1.367,DSS模型組為168.50±27.01,中劑量KGF-2組為48.04±23.21、高劑量KGF-2組為14.62±1.812。DSS模型組的滲透率最高,且與正常對照組(P=0.045)、中劑量KGF-2組(P=0.0277)、高劑量KGF-2組(P=0.0047) 的差異均有統計學意義。與DSS模型組相比,2個KGF組的FITC-D滲透率明顯下降(圖3)。

免疫組化正常對照組ZO-1和occludin主要位于上皮細胞的邊緣,細胞膜頂端,沿絨毛下方均勻連續分布;DSS模型組ZO-1和occludin蛋白分布不均、散亂、稀疏,染色變淡,線條模糊;KGF-2組ZO-1和occludin在結腸黏膜的上皮層中分布均勻,線條清晰(圖4)。采用Image Pro Plus 6.0以平均陽性光密度值(IOD/area)計算蛋白表達強度后,顯示DSS模型組結腸黏膜ZO-1(P=0.000 2)和occludin(P< 0.0001)蛋白表達較正常對照組顯著減少,中劑量KGF-2干預后,ZO-1表達較模型組增加(P=0.013 3),而occludin表達并無顯著提高;高劑量KGF-2干預后,ZO-1(P=0.003 3)和occludin(P=0.000 7)陽性表達較模型組顯著增加(圖5)。

圖3KGF-2對腸道FITC-D滲透率的影響
Fig3EffectofKGF-2onFITC-Dpermeability

Westernblot檢測用于測試緊密連接(tight junction,TJ)蛋白ZO-1和occludin在結腸組織中的表達。TJ蛋白在正常對照組的表達最高,在DSS模型組中顯著下降,KGF-2組TJ蛋白表達情況介于兩者之間(圖6)。采用Image Pro Plus 6.0計算灰度值后,顯示DSS模型組結腸黏膜ZO-1和occludin蛋白表達均較正常對照組顯著減少(ZO-1:P<0.000 1;occludin:P=0.007),高劑量KGF-2干預后,ZO-1和occludin陽性表達較模型組顯著增加(ZO-1:P<0.000 1;occludin:P=0.043 4),中劑量KGF-2干預后,ZO-1陽性表達較DSS模型組增加(P=0.001 7,圖5～6)。

ELISA檢測檢測結腸組織勻漿中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ、TGF-β1、IL-1β的水平,其中高劑量KGF-2組TNF-α(P<0.000 1)、IL-6(P=0.007 7) 和 IL-10 (P=0.002 4)的水平與模型組差異有統計學意義,而IL-1β、TGF-1β、IFN-γ各組間均差異無統計學意義(圖7)。

Colonic immunohistochemical staining on ZO-1 and occludin in Control (A),Model(B),Model+KGF-2 (5 mg/kg) (C) and Model+KGF-2 (10 mg/kg) (D).A lot of brown particles can be seen on glandular epithelium and intestinal epithelium in A.Only scattered brown granules were seen on glandular epithelium and intestinal epithelium in B,and the staining was the lightest.In C and D,more brown granules were seen on glandular epithelium and intestinal epithelium.

圖4ZO-1和occludin免疫組化染色(400×)
Fig4ColonicimmunohistochemicalstainingofZO-1andoccludin(400×)

圖5ZO-1和occludin免疫組化染色與Westernblot表達
Fig5ImmunohistochemistystainingandWesternblotofZO-1andoccludinexpression

圖6ZO-1和occludin的Westernblot表達
Fig6WesternblotphotographsofZO-1andoccludin

討 論

大量研究表明,腸道黏膜屏障功能障礙是IBD發病的重要機制之一。KGF-2能夠促進小腸上皮細胞增殖分化,修復黏膜屏障,被認為是能夠改善IBD臨床癥狀的潛在藥物。

本實驗中,給予3.5%DSS 7天后,DSS模型組各動物均出現不同程度的腹瀉、便血、體重下降、結腸縮短,光鏡下表現也符合結腸炎癥的病理學改變。DSS模型組和KGF-2組的小鼠飲用DSS溶液后,DAI評分均較0天時升高,證明實驗造模成功。腹腔注射KGF-2之后,實驗小鼠的腹瀉、便血、結腸縮短、體重下降等現象均有不同程度的減輕,DAI評分顯著下降,組織學檢查可見炎癥程度減輕、浸潤深度縮短、隱窩結構修復、病變范圍減少,高劑量KGF-2 (10 mg/kg)的保護效果比中劑量KGF-2 (5 mg/kg)更為顯著。結果證明,5 mg/kg和10 mg/kg劑量的KGF-2可以預防DSS誘導的小鼠結腸炎,這與Greenwood-Van等[7]和Meceli等[6]的研究成果一致。但在預實驗中,3 mg/kg劑量的KGF-2對小鼠結腸炎并無明顯的保護作用(數據未顯示在本文中),這與Miceli等[6]研究結果顯示的KGF-2最小起效濃度在1～3 mg/kg并不相符,可能由于小鼠對藥物敏感性的個體差異和飼養環境不同引起。在后續的機制研究中,我們也發現KGF-2的一些保護效應,如保護occludin表達水平、抑制TNF-α分泌、刺激IL-6分泌,需要10 mg/kg劑量才能被觀察到,由此可見KGF-2的預防作用具有劑量依賴性。

圖7KGF-2對細胞結腸組織細胞因子表達的作用
Fig7EffectofKGF-2oncytokinesincolontissue

FITC-D常作為提示腸道通透性的指示劑,而腸道通透性直接反映了腸道屏障的功能。本實驗各組之間FITC-D滲透率的差異表明,KGF-2可以減輕DSS引起的腸道通透性增高,修復受損的腸道黏膜。腸道通透性受到緊密連接蛋白復合物的調節[9],Occludin和ZO-1是緊密連接復合物中重要的結構蛋白。IBD患者的腸道病理組織中ZO-1和occludin表達降低[10]。為了深入探討KGF-2保護腸道黏膜屏障的機制,我們檢測了ZO-1和occludin在實驗小鼠腸道黏膜的表達情況,發現與正常對照組相比,KGF-2可以減輕DSS誘導的結腸炎引起的ZO-1和occludin表達下降,提示KGF-2可能參與調控ZO-1和occludin的表達。

既往研究表明,KGF-2的生物學效應是通過激活特異性受體FGFR來實現,KGF-2與特異性表達于上皮細胞表面的FGFR2b結合,形成FGF10-FGFR2b二聚體,使FGFR胞內段的酪氨酸激酶結構域磷酸化,激活胞內底物FRS2α和PLCγ1,FRS2α通過RAS-MAPK或PI3K-AKT信號通路調控生物學活動,PLCγ1激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)而發揮生物學效應[11]。PKC的激活可刺激ZO-1和occludin的轉錄,增加ZO-1和occludin的表達[12]。因此,我們推測KGF-2通過激活FRS2α和PLCγ1來激活PKC,提高ZO-1和occludin的表達水平,從而修復受損的腸道黏膜屏障。

我們檢測了各組小鼠腸道組織勻漿中的多種細胞因子以探究KGF-2對其影響。IBD疾病活動期腸道內的多個細胞因子分泌失衡,包括TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β和TGF-β1等[13]。我們使用ELISA檢測結腸組織勻漿中的促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ和抑炎因子 IL-10、TGF-β1,發現KGF-2可抑制TNF-α的產生,增加 IL-6和 IL-10的分泌。10 mg/kg KGF-2將結腸組織的TNF-α降到了與正常對照組相當的水平,同時刺激了IL-10和IL-6的分泌,經過10 mg/kg KGF-2給藥的小鼠結腸組織的IL-10和IL-6水平高于正常對照組。TNF-α能通過多種途徑促進炎癥,可直接損害上皮組織和緊密連接蛋白[14]。抗TNF-α治療可減輕炎癥并顯著抑制DSS誘導結腸炎引起的腸道通透性增加。IL-6是一個可由多種細胞分泌、具有多重生物學效應的細胞因子,IBD患者體內IL-6顯著提高。IL-6雖然是促炎因子,卻能促進腸道上皮細胞的增殖和分化,在IBD引起的潰瘍中,IL-6有利于黏膜愈合[13]。既往研究已經充分證實IL-10具有加強黏膜屏障功能[15],IL-10的表達水平與黏膜屏障信號標記分子的變化一致。因此,KGF-2也可能是通過抑制TNF-a的產生來減少對上皮和緊密連接蛋白的損害,保護腸道黏膜,從而緩解結腸炎癥。增加黏膜IL-6和IL-10的生成,促進上皮的增殖分化,加強黏膜屏障功能,可改善結腸炎癥。

綜上所述,KGF-2保護腸道黏膜屏障功能主要通過抑制TNF-α及促進IL-6和IL-10分泌來實現。此外,IFN-γ和IL-1β也是IBD相關的重要促炎因子[13]。TGF-β1可以抑制黏膜巨噬細胞和效應T細胞產生的促炎效應[16]。但本實驗未發現DSS與KGF-2對這3個因子產生明顯影響,DSS僅造成輕微的IL-6、IFN-γ 和 IL-1β升高,但差異無統計學意義,可能是樣本數量不足或實驗小鼠個體差異引起。而KGF-2未對IFN-γ 、IL-1β、TGFβ1產生效果,表明保護效應可能并非直接通過這3個細胞因子實現。

本研究證實,KGF-2可減輕DSS誘導的小鼠結腸炎,保護腸道屏障功能,其機制可能是通過增強腸道上皮緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達,同時抑制黏膜TNF-α及促進IL-6和IL-10分泌而發揮作用。KGF-2可能成為IBD治療和預防復發的重要補充藥物。

[1] KATZ KD,HOLLANDER D,VADHEIM CM,etal.Intestinal permeability in patients with Crohn’s disease and their healthy relatives[J].Gastroenterology,1989,97(4):927-931.

[2] TURNER JR.Intestinal mucosal barrier function in health and disease[J].NatRevImmunol,2009,9(11):799-809.

[3] D’INCA R,DI LEO V,CORRAO=G,etal.Intestinal permeability test as a predictor of clinical course in Crohn’s disease[J].AmJGastroenterol,1999,94(10):2956-2960.

[4] 楊志偉.角質細胞生長因子-2 (KGF-2)研究進展[J].海峽藥學,2016(7):7-10.

[5] ISHIWATA T,NAITO Z,LU YP,etal.Differential distribution of fibroblast growth factor (FGF)-7 and FGF-10 in L-arginine-induced acute pancreatitis[J].ExpMolPathol,2002,73(3):181-190.

[6] MICELI R,HUBERT M,SANTIAGO G,etal.Efficacy of keratinocyte growth factor-2 in dextran sulfate sodium-induced murine colitis[J].JPharmacolExpTher,1999,290(1):464-471.

[7] GREENWOOD-VAN MB,VENKOVA K,CONNOLLY K.Efficacy of repifermin (keratinocyte growth factor-2) against abnormalities in gastrointestinal mucosal transport in a murine model of colitis[J].JPharmPharmacol,2003,55(1):67-75.

[8] COOPER HS,MURTHY SN,SHAH RS,etal.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis[J].LabInvest,1993,69(2):238-249.

[9] LAUKOETTER MG,BRUEWER M,NUSRAT A.Regulation of the intestinal epithelial barrier by the apical junctional complex[J].CurrOpinGastroenterol,2006,22(2):85-89.

[10] DAS P,GOSWAMI P,DAS TK,etal.Comparative tight junction protein expressions in colonic Crohn’s disease,ulcerative colitis,and tuberculosis:a new perspective[J].VirchowsArch,2012,460(3):261-270.

[11] GOETZ R,MOHAMMADI M.Exploring mechanisms of FGF signalling through the lens of structural biology[J].NatRevMolCellBiol,2013,14(3):166-180.

[12] WEILER F,MARBE T,SCHEPPACH W,etal.Influence of protein kinase C on transcription of the tight junction elements ZO-1 and occludin[J].JCellPhysiol,2005,204(1):83-86.

[13] NEURATH MF.Cytokines in inflammatory bowel disease[J].NatRevImmunol,2014,14(5):329-342.

[14] YE D,MA I,MA TY.Molecular mechanism of tumor necrosis factor-alpha modulation of intestinal epithelial tight junction barrier[J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol, 2006,290(3):G496-G504.

[15] MARTINEZ-AUGUSTIN O,ROMERO-CALVO I,SUAREZ MD,etal.Molecular bases of impaired water and ion movements in inflammatory bowel diseases[J].InflammBowelDis,2009,15(1):114-127.

[16] LI MO,SANJABI S,FLAVELL RA.Transforming growth factor-beta controls development,homeostasis,and tolerance of T cells by regulatory T cell-dependent and -independent mechanisms[J].Immunity,2006,25(3):455-471.