下丘腦室旁核FKBP5在電針調節創傷應激后HPA軸中的作用

(復旦大學基礎醫學院中西醫結合學系 上海 200032)

外科手術是臨床上常見的治療手段,在治療疾病的同時難免給機體帶來組織創傷,而創傷能激活下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸,嚴重的創傷可能會誘發心血管疾病、胃腸潰瘍、情緒改變等[1-3],對人類的健康造成嚴重威脅。所以,如何有效地改善應激后HPA軸的活性已成為醫學界的一個熱門課題。然而,創傷后HPA軸的活性如何變化,特別是創傷后不同時間點的恢復情況尚不清楚,我們在前期工作中發現創傷后下丘腦促進腎上腺皮質釋放激素(corticotropinreleasing factor,CRF)的釋放與體溫均隨著應激反應的高峰和回復而呈現雙向性改變。而創傷誘導的應激反應主要由 HPA軸和腎上腺交感系統參與,HPA軸的激活主要來自于下丘腦室旁核(paraventricular nucleus,PVN)神經元的興奮,這些神經元投射到正中隆起會促使CRF和精氨酸加壓素(arginine vasopressin,AVP)釋放,同時也引起垂體和腎上腺皮質分泌促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)和糖皮質激素(glucocorticoid,GC),外周產生的GC能通過負反饋神經環路作用到PVN神經元而影響HPA軸功能[4]。

FKBP5作為糖皮質激素受體(GC receptor,GR)的伴侶蛋白,在GC與GR發揮作用的過程中起橋梁作用。FKBP5能介導體外FK506抑制鈣調磷酸酶過程,最初在小鼠T淋巴細胞和胸腺上被發現[5],且在人體的腎臟、骨骼肌、肝臟、胎盤、心臟、外周血液中表達較多,但大腦鮮有表達。之后研究發現大腦中眾多區域也有不同程度的表達,包括海馬、皮層、杏仁核及下丘腦等,其主要分布在神經元上,星型膠質細胞中只有少量表達[6-7]。正常的細胞環境下,FKBP5與GR和熱休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)組成的復合物多存在于細胞質中,一旦受到激素的影響就會被FKBP4替換,變成游離狀態,隨后重組,為下一次GR成熟的核轉運做準備[8]。FKBP5作為GR活性的負性調節因子,能通過負反饋短回路抑制GR的活化,進而調節GR下游的信號傳遞[9],可見FKBP5在HPA軸負反饋環路末端的調節有至關重要的作用。已有許多文獻表明電針能有效調節HPA軸活性[10-11],即往研究主要集中在激素的分泌,現更多關注GC的負反饋作用,因此我們擬用經典的創傷模型,觀察創傷后HPA軸活性的變化,并探討電針對其的作用。

材 料 和 方 法

實驗動物雄性SD大鼠60只,體重(200±20)g,清潔級,購自中國科學院上海實驗動物中心。用于建造創傷應激模型的雄性SD大鼠分籠飼養,室溫控制在22～25 ℃,12 h/12 h晝夜交替,自由攝食飲水,在實驗環境中適應1周后進行正式實驗。對所有動物的處理均符合國際實驗動物使用準則。

藥品與試劑羊兔抗c-fos IgG (英國Abcam公司,ab7963),羊兔抗FOSB IgG (美國Santa Cruz公司,sc-48),羊兔抗FKBP5 IgG (英國Abcam公司,ab2901)。

主要儀器LH202H韓式穴位神經刺激儀(北京華運安特科技有限責任公司),歐姆龍電子體溫計 MC-347,萊卡顯微鏡。

動物分組及模型制備60只SD雄性大鼠隨機分為對照組、創傷1天組、創傷3天組、創傷7天組及電針干預組,每組12只,分別作灌流及新鮮取材。創傷組腹、背部中線分別行6 cm和5 cm的縱行切口,背部切口以暴露脊髓為度,腹部模擬臟器探查術,暴露臟器1～2 min,檢查有無病灶及損失,隨后縫合。電針組在創傷后立即給予大鼠雙側后肢“三陰交”(SP-6)和“足三里”(ST-36)電針刺激,參數為疏密波(2/100 Hz),連續刺激30 min,對照組不做任何處理,各組于相應的時間點進行體溫測量,灌流取材及新鮮取材。

體溫測量固定大鼠,讓其處于安靜環境30 min,體溫相對平穩后將電子體溫計的測溫探頭插入大鼠肛門約5 cm,測量3次直腸溫度,取平均值。

放射免疫技術測定血清激素CRF、ACTH和CORT將大鼠斷頭處死,取軀干血及冰上分離下丘腦組織,血液于室溫放置2 h,4 ℃下587×g離心30 min,分離血清,-80 ℃保存備用。由北京華英生物技術研究所測定血清CRF、ACTH和CORT。

切片制備及免疫組化染色方法動物造模后相應的時間點,在麻醉狀況下用4%多聚甲醛經左心室灌注固定,取腦并將腦組織置于相同固定液中后固定,4 ℃過夜,用梯度蔗糖浸泡沉底,-20 ℃恒低溫切片機切片,厚度為30 μm,留取含下丘腦PVN的腦組織切片備用。37 ℃下用3% H2O2處理30 min,PBS 漂洗10 min×3;再用含1%BSA和10%羊血清的0.3%PBST封閉1h,分別滴加羊抗兔c-fos抗體(1∶1 000,ab7963)、羊抗兔FOSB 抗體(1∶200,sc-48)和羊抗兔FKBP5 抗體(1∶300,ab2901);用0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照,37 ℃孵育1 h,4 ℃過夜,滴加生物素化羊抗兔IgG (1∶200),37 ℃放置60 min,滴加含ABC的復合物(1∶200),37 ℃孵育1 h。以上各步驟間用0.01 mol/L PBS 漂洗10 min×3,最后用DAB顯色,常規脫水至透明,中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察下丘腦PVN中FKBP5的表達,攝片,每張切片隨機選3～5個視野計數陽性細胞,取平均值。

Westernblot檢測將大鼠下丘腦組織從冰箱取出,置于冰上,按1∶100加入蛋白酶抑制劑PMSF至RIPA裂解液中,再裝有組織的離心管中加入混勻的裂解液100 mg/mL,置于冰上10 min。在冰浴中勻漿,每次15 s,共3次,每次間隔5 min。在冰浴中靜置20 min,4 ℃下15 871×g離心20 min,取上清液,分裝后置于-80℃冰箱保存備用,同時取1 μL用于測量樣品的蛋白濃度。待測樣品(蛋白含量40 μg)中加入等體積的2×SDS樣品緩沖液,混勻后置于沸水中變性10 min,上樣于12%SDS-PAGE凝膠上,濃縮膠電壓為80 V,分離膠電壓為130 V,總時長約2 h;300 mA恒流70 min轉至PVDF膜。將轉印膜放入封閉液(含5% BSA的TBST),4 ℃封閉2 h,將轉印膜放入含5% BSA的TBST稀釋的一抗(1∶1 000),4 ℃震蕩孵育過夜。TBST室溫洗膜4次,每次15 min,將轉印膜放入含5% BSA的TBST稀釋的HRP耦聯的二抗(1∶500)中,4 ℃震蕩孵育2 h。TBST室溫洗膜4次,每次15 min,加入Luminol Ecl試劑(同體積混合A液和B液),室溫下靜置2 min,于Image Quant LAS 4 000 mini超靈敏化學發光儀中自動曝光,拍照保存,用PhotoShop CS6軟件對條帶進行定量分析及數據處理。

結 果

創傷后不同時間點的體溫變化與對照組比較,創傷1天組的大鼠體溫升高(P<0.05),創傷3天組和創傷7天組與對照組比較差異均無統計學意義(圖1),這提示創傷應激后機體可能存在HPA軸活性變化,特別是創傷后第1天。

創傷后不同時間點下丘腦PVN神經元活性的變化與對照組比較,創傷1天后大鼠下丘腦PVN c-fos表達(P<0.001)與FOSB表達(P<0.01)明顯升高,創傷3天組和創傷7天組與對照組比較差異均無統計學意義(圖2)。提示創傷1天后HPA軸調控中樞下丘腦PVN的神經元活性最高。

創傷1天后血清CRF-ACTH-CORT的變化及電針的影響除了觀察中樞HPA軸,我們還通過外周血清激素水平觀察了HPA軸的變化情況。與對照組比較,創傷1天組的大鼠血清ACTH(P<0.01)及CORT水平(P<0.001)顯著升高,提示創傷后1天HPA軸活性達到高峰,因此我們在這一時間點給予電針作為干預,并在1天后取材觀察電針的影響(圖3)。結果發現電針干預組與創傷1天組相比,ACTH(P<0.05)和CORT表達下降(P<0.01),提示電針能下調創傷后HPA軸活性。

創傷后1天后下丘腦PVN中FKBP5的變化及電針的影響與對照組比較,創傷1天后的大鼠下丘腦PVN中FKBP5表達升高(P<0.01),而電針干預組與創傷1天組相比,FKBP5表達下降(P<0.05,圖4)。上述結果提示電針能下調創傷后HPA

軸的活性,可能通過FKBP5發揮作用。

圖1創傷后不同時間點的體溫變化
Fig1Bodytemperatureofratsatdifferent
timepointsaftertrauma

圖2大鼠創傷后不同時間點下丘腦PVN中FOS陽性細胞的表達
Fig2ExpressionsofFOSimmunopositivecellsinhypothalamicPVNatdifferenttimepointsaftertrauma

討 論

應激是機體在受到各種強烈因素刺激時所出現的非特異性全身反應。適度的應激會使機體作出代償性反應,以維持自身的內環境穩定,而持續或者強烈的應激會引起神經-免疫-內分泌系統的失調,導致機體功能紊亂和器官的損傷,但臨床上仍缺乏有效的治療方法。外科手術是一種常見的疾病治療方式,但其所導致的創傷應激在不同時間點的恢復情況尚不清楚。

我們觀察到創傷應激后大鼠的體溫與對照組比較呈現上升趨勢,特別是在創傷后第1天。向腦室內注射微量的CRF和內皮素后大鼠體溫明顯高于正常大鼠[12];也有研究表明暴露在高溫環境下,動物體溫升高,同時下丘腦PVN CRF mRNA表達增加,外周血清皮質酮升高,其機制可能與HPA軸相關[13];我們前期工作發現創傷后免疫功能受到不同程度的抑制,自然殺傷細胞活性降低,淋巴細胞增殖功能減弱,中樞IL-1β生成增多[14],而下丘腦CRF的釋放與體溫均隨著應激反應的高峰和回復而呈現雙向性改變,可能是創傷應激后誘導產生的IL-1和CRF的綜合作用,使得下丘腦體溫調定點發生變化。上述結果說明創傷后機體存在HPA軸活性的變化,特別是創傷后1天。

圖3大鼠創傷1天及電針干預后血清CRF、ACTH和CORT的水平變化
Fig3SerumlevelsofCRF,ACTHandCORTinrats1dayaftertraumaandtreatedwithEA

圖4大鼠創傷1天及電針干預后下丘腦

PVNFKBP5的表達變化

Fig4FKBP5expressioninhypothalamicPVN1dayaftertraumaandtreatedwithEA

HPA軸的激活首先是下丘腦PVN神經元興奮,而神經元的興奮往往伴隨FOS的表達。FOS家族是一類被廣泛應用的即早基因,c-fos是其中一種,其常在急性應激后2 h達到高峰并逐漸回落,能反映急性應激狀態[15]。在正常的情況下c-fos表達不多,而在應激后很多腦區會有高表達,特別是與HPA軸相關的PVN和海馬區等,有報道在束縛-浸水應激后PVN的c-fos和c-jun明顯升高[16]。在社會心理應激動物模型中發現PVN的c-fos均升高,同時c-fos能誘導CRF的釋放而啟動HPA軸[17];而另一類即早基因FOSB常在應激后6 h開始升高,其代謝持續時間較長,有實驗表明抑郁模型大鼠的海馬FOSB表達升高,在慢性束縛應激后PVN的FOSB表達上調[18],另外在許多藥物成癮過程中腦內獎賞系統的FOSB亦增加[19-20],所以其能夠反映慢性應激狀態。HPA軸的激活關鍵是下丘腦PVN神經元興奮,但創傷后不同時間點可能有不同的應激狀態,因此利用c-fos與FOSB結合可以更好地觀察不同時間點的神經元活性,從而比較機體應激反應的程度。我們的實驗結果表明,對照組的c-fos表達水平低,創傷后1天PVN的c-fos表達與對照組相比明顯升高,創傷后3天已經基本回落到基礎水平,而FOSB也有相似的趨勢,提示創傷屬于急性應激反應,其HPA軸的激活較早并且持續的時間較短,PVN神經元的活性在創傷后1天時達到最高。

PVN興奮后通過c-fos誘導釋放CRF來啟動激素的調節通路。CRF是最上游的調節因子,能作用到垂體使其分泌ACTH,ACTH通過血液作用到外周的腎上腺,促使其分泌GC。我們的實驗結果發現,血清的CRF、ACTH及CORT的水平在創傷后1天達到高峰,創傷后3天已無明顯升高,充分說明創傷后1天的HPA軸活性處于高峰。于是在創傷模型上采用電針作為干預治療,并在創傷1天后取材觀察電針的作用。有報道指出,電針能改善抑郁癥和慢性疲勞性大鼠的激素分泌功能[21],同時能穩定急性創傷后的HPA軸功能,下調應激激素水平[22]。已有經典創傷模型及肝部分切除模型實驗證實,電針能夠下調創傷后下丘腦CRF表達[23-24]。這些研究結果說明電針能有效地調節HPA軸的活性,我們對血清CRF、ACTH和CROT水平的檢測發現電針能下調創傷后1天的激素水平,亦證實了這一點。

電針能下調創傷后HPA軸活性,但即往研究主要集中在激素水平變化,關于GR的負反饋作用研究甚少。HPA軸興奮產生的GC能進入靶細胞而影響FKBP5的表達,進而影響GR的核轉運和成熟[25],而GR在PVN、前額皮層及邊緣系統的表達會通過負反饋環路影響HPA軸的活性[26-27],因此,FKBP5是負反饋調節的關鍵因子,PVN作為HPA軸的負反饋的核心,其FKBP5的作用變化更為重要。慢性可的松實驗中,海馬、下丘腦和外周血中FKBP5表達升高[28],下丘腦FKBP5在束縛應激和食物剝奪實驗24 h后達到高峰[29]。本研究結果表明,FKBP5在創傷后1天與對照組比較明顯升高,這可能跟創傷后激素水平升高造成負反饋功能下降有關,而電針能下調FKBP5,促使其負反饋功能恢復,這可能是FKBP5參與電針調節創傷后HPA活性的作用機制之一。

綜上所述,創傷能激活HPA軸,創傷后1天是一個重要的應激時間點。電針能下調創傷后HPA軸的活性,其可能通過FKBP5發揮作用。

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