改良Blocker PCR檢測(cè)EGFR-TKI耐藥后非小細(xì)胞肺癌血漿EGFR T790M突變的價(jià)值

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科 上海 200032; 2上海允英醫(yī)療科技有限公司 上海 201216)

表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)已廣泛應(yīng)用于EGFR基因突變的晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者的治療[1-2]。然而,在應(yīng)用EGFR-TKI的過(guò)程中,對(duì)初始治療有應(yīng)答的患者不可避免的在1～2年內(nèi)出現(xiàn)獲得性耐藥。既往研究表明,EGFR-TKI 獲得性耐藥機(jī)制中約50% 歸因于T790M突變。為明確耐藥原因,臨床常規(guī)推薦組織二次活檢。然而,二次活檢為創(chuàng)傷性操作,不僅風(fēng)險(xiǎn)大,而且由于腫瘤組織存在異質(zhì)性,組織活檢有時(shí)不能反映腫瘤組織整體的基因突變狀況[3-5]。血漿游離DNA(cell free DNA,cfDNA)基因突變檢測(cè)不僅創(chuàng)傷小,容易取材,避免二次活檢的創(chuàng)傷,而且能夠多次動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)治療過(guò)程中的基因突變狀態(tài),為不宜二次活檢的肺癌患者提供持續(xù)精準(zhǔn)治療的依據(jù)[6-7]。

本研究采用Blocker PCR 對(duì)EGFR-TKI 獲得性耐藥的NSCLC患者檢測(cè)血漿cfDNA中EGFR敏感突變和T790M耐藥突變,并采用配對(duì)組織檢測(cè)及二代測(cè)序(next generation sequencing,NGS)方法驗(yàn)證其可靠性,探討B(tài)locker PCR在獲得性T790M監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

材 料 和 方 法

病例收集收集2015年3月至2016年9月期間就診于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科并符合以下入組標(biāo)準(zhǔn)的病例:(1)治療前存在EGFR敏感突變或EGFR-TKI治療有效;(2)經(jīng)過(guò)EGFR-TKI治療初始有應(yīng)答;(3) RECIST標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估疾病出現(xiàn)進(jìn)展。符合入組標(biāo)準(zhǔn)的病例共127例,入組病例行血檢EGFR敏感突變及T790M耐藥突變檢測(cè);并選取部分病例血漿標(biāo)本行NGS與Blocker PCR配對(duì)比較;為了驗(yàn)證血液檢測(cè)的可靠性,同時(shí)采用二次活檢組織與血漿檢測(cè)配對(duì)比較。然而,二次組織活檢在患者中難以開(kāi)展,本組病例中僅有11例病例經(jīng)二次活檢。由于二次組織活檢病例較少,無(wú)法評(píng)估血檢的可靠性,而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,EGFR-TKI耐藥的敏感突變與原始敏感突變保持一致[8-9]。故本研究選取部分EGFR-TKI耐藥后血漿檢出EGFR敏感突變的病例與治療前組織標(biāo)本行Blocker PCR配對(duì)比較。

分離血漿cfDNA抽提取抗凝血約5 mL置于EDTA抗凝管中,于室溫下120×g離心20 min,分離上清,于4 ℃下16 000×g離心10 min,留取上清行血漿循環(huán)腫瘤DNA (circulating tumor DNA,ctDNA)抽提。采用循環(huán)腫瘤DNA抽提試劑盒(上海允英醫(yī)療科技有限公司)進(jìn)行血漿ctDNA抽提,根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。抽提cfDNA,進(jìn)行定量。根據(jù) Qubit微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Life Technology公司)檢測(cè)濃度值,樣品濃度定量在0.5～10 ng/μL。

BlockerPCR基因突變檢測(cè)根據(jù)Genbank公布的人EGFR基因序列,由上海允英醫(yī)療科技有限公司設(shè)計(jì)合成EGFR第18、19、20、21外顯子基因特異性引物和探針(專利申請(qǐng)碼:201510187617.3)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL,模板2 μL,擴(kuò)增條件為95 ℃變性10 min后進(jìn)入主循環(huán):95 ℃,15 s;60 ℃,1 min;15個(gè)循環(huán)后,重復(fù)95 ℃,15 s,60 ℃,1 min;35個(gè)循環(huán)后所得PCR產(chǎn)物,經(jīng)SDS 2.0軟件系統(tǒng)測(cè)定。

二代測(cè)序基因檢測(cè)根據(jù)VAHTS Nano DNA Library Prep Kit for Illumina 試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cfDNA文庫(kù)制備,cfDNA 片段長(zhǎng)度約為160 bp;超深度測(cè)序的靶基因譜包括23個(gè)NSCLC相關(guān)基因,靶基因的富集應(yīng)用SureSelect Target富集系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司);捕獲的DNA文庫(kù)在NextSeq 500測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)上機(jī)測(cè)序。數(shù)據(jù)處理參考Newman 等[10]的生物信息學(xué)方法,檢測(cè)單核苷酸點(diǎn)突變及缺失突變,采用具有后處理過(guò)濾器功能的VarScan 2[11]來(lái)提高突變識(shí)別可信度(variant call confidence),對(duì)融合突變及斷點(diǎn)的表征采用融合與染色體易位計(jì)數(shù)與恢復(fù)算法(fusion and chromosomal translocation enumeration and recovery algorithm,FACTERA)[10]。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及百分比表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

入組病例基本情況127例經(jīng)過(guò)EGFR-TKI治療后出現(xiàn)進(jìn)展的患者中(表1),男性56例(44.10%),女性71例(55.90%);年齡27～83歲,平均63歲;124例(97.63%)為肺腺癌患者;56例(44.09%)患者接受EGFR-TKI一線治療,74例(55.91%)經(jīng)二線或三線EGFR-TKI治療;120例(94.49%)為肺癌Ⅳ期患者。

BlockerPCR血漿檢測(cè)結(jié)果127例EGFR-TKI耐藥后患者的血漿標(biāo)本中,40.15% (51/127)的樣本含有T790M突變,其中21.57% (11/51)為單純T790M突變,78.43%(40/51)為T(mén)790M合并EGFR敏感突變;59.84% (76/127)的樣本為T(mén)790M陰性,其中37例為單純EGFR敏感突變,36例為野生型突變,3例為其他突變:1例為E19-DELs+c-met擴(kuò)增,1例為E19-DELs+ALK融合突變,1例為L(zhǎng)858R+HER-2 插入突變(圖1)。

圖1 Blocker PCR 在血漿中的基因突變檢測(cè)結(jié)果Fig 1 EGFR sensitizing mutations and T790M mutationsdetected by Blocker PCR in plasma

組織與血漿基因檢測(cè)結(jié)果比較11例EGFR-TKI耐藥后的入組病例行二次活檢組織和配對(duì)血漿基因檢測(cè),二次活檢組織結(jié)果與血漿檢測(cè)結(jié)果具有較高一致率(圖2),其中僅有1例編號(hào)為3的病例檢測(cè)結(jié)果不一致;在EGFR-TKI耐藥后二次活檢組織標(biāo)本中T790M陽(yáng)性例數(shù)為6例,T790M檢出率為54.54% (6/11)。

PD:Progression development;E19-DELs:Deletion of exon 19;WT:Wild type.

圖2二次活檢組織與配對(duì)血漿基因檢測(cè)結(jié)果
Fig2EGFRmutationsinplasmaandpairedtumorrebiopsies

由于二次活檢的病例較少,無(wú)法評(píng)估血漿T790M檢測(cè)的準(zhǔn)確性,因此,我們檢測(cè)了21例未經(jīng)EGFR-TKI治療的首次活檢組織標(biāo)本及該21例病例經(jīng)EGFR-TKI治療后耐藥的配對(duì)血漿標(biāo)本。如圖3所示,EGFR-TKI耐藥后血漿攜帶的敏感突變類型為治療前組織原有敏感突變類型,未出現(xiàn)突變亞型之間的轉(zhuǎn)化,僅有2例在EGFR-TKI耐藥后出現(xiàn)野生型。EGFR-TKI耐藥后的32例血漿標(biāo)本中共14例為T(mén)790M陽(yáng)性(圖2～3),因而血漿T790M的檢出率為43.75% (14/32)。

PD:Progression development;E19-DELs:Deletion of exon 19;WT:Wild type.

圖3首次活檢組織與耐藥后配對(duì)血漿基因檢測(cè)結(jié)果
Fig3EGFRmutationsinpost-PDplasmasamplesandpairedprimarytumortissues

二代測(cè)序與BlockerPCR突變檢測(cè)的比較在EGFR和T790M突變位點(diǎn),二代測(cè)序和Blocker PCR對(duì)18例EGFR-TKI耐藥后患者的檢出率完全一致,均為100%。其中 6例(33%)為EGFR敏感突變合并T790M突變;4例(22%)為單純敏感突變;8例(22%)為野生型。二代測(cè)序還檢測(cè)到文獻(xiàn)報(bào)道的其他EGFR-TKI耐藥相關(guān)突變位點(diǎn),如KRAS、PTEN、PIK3CA、MET、BIM和ROS-1等(圖4)。

圖4 二代測(cè)序基因檢測(cè)結(jié)果與Blocker PCR檢測(cè)結(jié)果一致性 Fig 4 Concordance of mutations identified by Blocker PCR and NGS in plasma

討 論

EGFR基因突變是NSCLC的驅(qū)動(dòng)基因之一,目前約30%～40%的亞洲NSCLC患者在確診時(shí)攜帶有EGFR基因突變,根據(jù)NCCN指南、ASCO指南及《中國(guó)原發(fā)性肺癌診療規(guī)范》推薦,EGFR-TKI一線治療是EGFR突變的晚期NSCLC患者的主要治療方法[12]。在應(yīng)用EGFR-TKI的治療過(guò)程中,對(duì)初始EGFR-TKI治療應(yīng)答良好的患者不可避免地出現(xiàn)疾病進(jìn)展,對(duì)原始靶向藥物產(chǎn)生獲得性耐藥,腫瘤基因突變狀態(tài)發(fā)生改變。EGFR-TKI 獲得性耐藥機(jī)制中,約50%為T(mén)790M突變[13],其他耐藥機(jī)制包括c-met擴(kuò)增、HER-2突變、PIK3CA和KRAS等[13-14]。對(duì)一代EGFR-TKI繼發(fā)性耐藥并存在T790M突變的患者,三代EGFR-TKI 奧希替尼(Osimertinib,AZD9291,英國(guó)阿斯利康制藥有限公司)取得非常好的療效,治療緩解率達(dá)到63%,PFS可達(dá)9.7個(gè)月[15]。因此,是否存在T790M突變顯得尤為重要,目前推薦對(duì)進(jìn)展的腫瘤行二次活檢基因突變檢測(cè)[16]。然而,二次活檢不僅創(chuàng)傷大,危險(xiǎn)性高,而且腫瘤組織存在異質(zhì)性,二次活檢組織不能夠反映腫瘤的整體突變狀況[17]。

cfDNA能夠反映腫瘤的分子生物學(xué)特征(如基因突變、甲基化等),cfDNA基因檢測(cè)不僅可避免二次活檢的創(chuàng)傷,而且能反復(fù)取材,在靶向治療的過(guò)程中,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)基因突變狀態(tài)的改變[6,18-19]。然而,液體活檢同時(shí)也面臨著諸多缺陷,與組織活檢相比,雖然其特異性可達(dá)90%以上,其敏感性卻因采用的方法不同而有差異。例如,以組織基因檢測(cè)作為金標(biāo)準(zhǔn),采用ARMS 血漿基因檢測(cè)EGFR敏感突變中,敏感性為75%[20]。采用cobas 血液檢測(cè)對(duì)EGFR敏感突變的敏感性可以提高到82%[21]。采用數(shù)字PCR方法對(duì)ctDNA進(jìn)行EGFR敏感基因突變檢測(cè),敏感性達(dá)到80%以上[22-23]。但據(jù)既往報(bào)告,基于PCR技術(shù)檢測(cè)血漿T790M突變則不盡如人意,Kenneth等[21]比較了cobasEGFR突變檢測(cè)方法、therascreenEGFRARMS方法、微滴數(shù)字PCR和BEAMing 數(shù)字 PCR在檢測(cè)T790M的應(yīng)用,以組織為標(biāo)準(zhǔn),檢測(cè)T790M的敏感性最高僅達(dá)到73%。據(jù)分析,T790M突變區(qū)域影響PCR引物結(jié)合,從而導(dǎo)致PCR方法檢測(cè)此位點(diǎn)的敏感性不高。最新研究發(fā)現(xiàn)足夠深度的測(cè)序技術(shù)在晚期NSCLCT790M的檢測(cè)方面具有更高的檢出優(yōu)勢(shì),但是由于NGS成本高,耗時(shí)長(zhǎng),因而在臨床應(yīng)用存在困難[24-25]。

本研究采用Blocker PCR方法對(duì)一代EGFR-TKI耐藥患者血漿T790M基因突變進(jìn)行檢測(cè),T790M突變檢出率為40.16%,而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,組織二次活檢T790M的檢出率約為50%,本研究與二次活檢組織的檢出率相似[26-27]。此外,本研究血漿檢出T790M突變的患者中,T790M合并敏感突變占78.44%。Zheng等[8]研究發(fā)現(xiàn),在117例患者的血漿檢測(cè)中,T790M合并敏感突變比單純T790M突變所占比例要大[8]。NGS是近年興起的高通量的測(cè)序方法,其通量高,實(shí)驗(yàn)流程穩(wěn)定,重復(fù)性好,能夠檢測(cè)未知的基因突變[10,28]。為了檢測(cè)Blocker PCR的可靠性,本文選取18例經(jīng)Blocker PCR 檢測(cè)的血漿樣本同時(shí)行NGS檢測(cè),無(wú)論是在EGFR敏感突變位點(diǎn)還是在T790M突變位點(diǎn),NGS與Blocker PCR的檢測(cè)結(jié)果一致率均為100%。為了驗(yàn)證血液檢測(cè)的可靠性,通常以同期二次活檢組織為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較,但在臨床上二次活檢在患者中難以開(kāi)展。本研究中僅有11例病例經(jīng)二次活檢,由于病例較少,無(wú)法評(píng)估血液檢測(cè)的可靠性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,EGFR-TKI耐藥后攜帶的敏感突變與EGFR-TKI治療前原始敏感突變保持一致,很少發(fā)生轉(zhuǎn)化[9,29]。故本文選取EGFR-TKI耐藥后的血漿檢出EGFR敏感突變的病例與EGFR-TKI治療前組織相比較,結(jié)果顯示,耐藥后血漿的敏感突變位點(diǎn)與EGFR-TKI治療前的組織敏感突變位點(diǎn)完全一致。總之,通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道的組織T790M陽(yáng)性率比較,同一血漿標(biāo)本NGS與Blocker PCR 相驗(yàn)證,并通過(guò)組織與血漿相比較,均表明本研究所用的Blocker PCR檢測(cè)血漿T790M具有可靠性。

本研究之所以能夠提高血漿T790M檢出率,使其接近二次活檢組織EGFRT790M檢出率,一方面是在血漿cfDNA的抽提技術(shù)方面做了改進(jìn),綜合了物理和化學(xué)的方法提取更高比例的ctDNA;另一方面是采用了Blocker PCR的檢測(cè)技術(shù),Blocker PCR 在血液檢測(cè)中具有較高的靈敏度,可以達(dá)到0.1%。其原理主要是通過(guò)改造 5’和 3’端探針的結(jié)構(gòu),使改造后的探針與野生型等位基因特異結(jié)合的最適溫度比與突變型結(jié)合的溫度高10 ℃。在溫度由 95 ℃降至 60 ℃的過(guò)程中,探針與野生型等位基因特異結(jié)合從而被阻滯。當(dāng)溫度降至60 ℃時(shí),大部分的野生型等位基因被探針特異性阻滯,突變型等位基因則相對(duì)富集,因此突變特異性探針能夠特異性的擴(kuò)增突變的DNA鏈而不被野生型等位基因所干擾。與此同時(shí),通過(guò)優(yōu)化T790M探針及反應(yīng)條件,克服了基于PCR方法對(duì)T790M檢出率低的缺陷。在前期100余例EGFR-TKI治療前組織與治療前配對(duì)血漿的研究中,Blocker PCR 結(jié)合改良后的抽提方法可以將敏感突變的檢測(cè)敏感性提高到95%(相關(guān)研究另行投稿,數(shù)據(jù)在本文中未提供)。血漿基因檢測(cè)是個(gè)體精準(zhǔn)治療的理想方式,但EGFR-TKI耐藥后血檢T790M檢出率相對(duì)較低是其一大弊端。AZD9291上市的同時(shí),FDA批準(zhǔn)了第1個(gè)EGFR耐藥突變伴隨檢驗(yàn)試劑盒cobas EGFR Mutation Test v2,而Cobas血漿檢測(cè)T790M的敏感性為77%(30/41),特異性為67%(16/24)[21]。本研究通過(guò)改良抽提方法及Blocker PCR改良,使T790M檢出率更加接近組織突變狀態(tài),能夠提高依靠液體活檢指導(dǎo)臨床用藥的可靠性。在靶向治療的肺癌患者中,使用Blocker PCR在cfDNA中檢測(cè)耐藥突變,尤其是檢測(cè)T790M突變,是應(yīng)用AZD9291等新一代靶向藥物的重要依據(jù)。此外,Blocker PCR也可以檢測(cè)c-met、HER-2、KRAS等基因突變,相對(duì)彌補(bǔ)了其檢測(cè)廣度不如NGS全面的不足。無(wú)論是耗時(shí)還是花費(fèi),Blocker PCR都比NGS更有優(yōu)勢(shì)。

本研究的不足之處在于:(1)由于二次活檢組織難以獲取,因而組織配對(duì)標(biāo)本量比較少;(2)研究進(jìn)行時(shí)AZD9291在國(guó)內(nèi)尚未批準(zhǔn)上市,故血液檢測(cè)到T790M突變的患者無(wú)法用后續(xù)靶向治療效果驗(yàn)證。綜上所述,經(jīng)過(guò)改良的血漿cfDNA抽提方法合并Blocker PCR 檢測(cè)T790M突變有望指導(dǎo)無(wú)法獲取二次活檢組織的患者后續(xù)EGFR-TKI的選用。

致謝計(jì)海嬰醫(yī)師、裴東妮女士和趙海蓮女士在血液標(biāo)本收集的過(guò)程中提供了幫助。

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