結(jié)直腸癌患者血清miRNA-767-3p水平及其診斷意義

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科 上海 200032)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是胃腸道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。根據(jù)中國(guó)國(guó)家癌癥登記中心數(shù)據(jù)估計(jì),CRC已成為我國(guó)第5大高發(fā)癌癥及癌癥相關(guān)死亡原因[1]。CRC及結(jié)直腸腺瘤(colorectal adenoma,CA)等癌前病變的早診斷、早治療,能夠顯著提高CRC的檢出率并改善預(yù)后[2]。目前,結(jié)直腸腫瘤的診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”為電子結(jié)腸鏡檢查,其具有侵入性、成本高、技術(shù)要求較高及出血、穿孔并發(fā)癥等缺點(diǎn),不宜在人群中進(jìn)行大范圍篩查。而常用的非侵入性CRC篩查指標(biāo),如糞便隱血、糞便脫落細(xì)胞學(xué)檢查、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)等,早期診斷敏感性較差,因此有必要進(jìn)一步探索敏感、可靠、非侵入性的CRC早期篩查和診斷指標(biāo)以提高早期CRC的診斷率。

miRNA是一類由19～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA,可與mRNA互補(bǔ)片段結(jié)合,降低相關(guān)mRNA穩(wěn)定性和翻譯水平,從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化及凋亡、影響干細(xì)胞自我更新、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化等作用[3-4]。研究表明,多種miRNA在惡性腫瘤患者的血液循環(huán)及腫瘤組織的表達(dá)水平顯著升高或降低,并可作為惡性腫瘤的診斷標(biāo)志物[5-6]。

研究表明,miRNA-767在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的過(guò)表達(dá)可以改變抑癌基因的5-羥甲基胞嘧啶含量,并調(diào)節(jié)其甲基化水平[7]。CRC患者腫瘤組織DNA中存在甲基化異常,因此推測(cè)miRNA-767水平在組織及血液循環(huán)中可能升高。劉寒梢等[8]通過(guò)miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)7例CRC患者血清和10例健康志愿者血清中差異表達(dá)的miRNA,發(fā)現(xiàn)miRNA-767-3p在CRC患者血清中存在特異性升高。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative PCR,qRT-PCR)方法,檢測(cè)CRC、CA患者及健康人血清中miRNA-767-3p水平,并與血清CEA濃度相比較,以期分析血清miRNA-767-3p表達(dá)水平與CRC及相關(guān)癌前病變臨床病理參數(shù)間的關(guān)系,并初步評(píng)價(jià)其對(duì)CRC的診斷價(jià)值。

資 料 和 方 法

臨床資料選擇2015年7至9月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院就診的85例經(jīng)手術(shù)后病理診斷為CRC的患者及53例經(jīng)腸鏡病理診斷為CA患者為研究對(duì)象,同時(shí)選擇84例正常健康人為對(duì)照(normal control,NC)組,采集術(shù)前血清用于檢測(cè)。其中,CRC組患者男51例,女34例,年齡30～84歲,均無(wú)術(shù)前放化療史,按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)/國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC) CRC TNM分期系統(tǒng)(2010年第7版)進(jìn)行分期。CA組患者男39例,女14例,年齡28～86歲;NC組男50例,女34例,年齡22～59歲,排除腫瘤性疾病。所有患者及健康志愿者均填寫《知情同意書》。CRC組、CA組及NC組的不同臨床病理參數(shù),如平均年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期、病變位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)等,詳見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌組、結(jié)直腸腺瘤組及健康對(duì)照組的臨床病理參數(shù)Tab 1 Clinicopathological features of CRC group,CA group and NC group

CRC:Colorectal cancer;CA:Colorectal adenomatosis;NC:Normal control.

試劑和儀器SST血清分離管為美國(guó)BD公司產(chǎn)品;miRcuteTMmiRNA提取分離試劑盒(DP501)、miRcuteTMmiRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(KR201)、miRcuteTM增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(FP411)、miRNA-767-3p引物(5’-UCUGCUCAUACCCCAUGGUUUCU-3’)及外參引物秀麗隱桿線蟲(chóng)miR-39 (cel-miR-39)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;紫外分光光度儀(NanoDrop 2000c)為美國(guó)Thermo-Fisher Scientific公司產(chǎn)品;ABI-7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀為美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品;全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(BioPlexTM2200)為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

血清總RNA提取清晨空腹抽取患者及健康志愿者外周靜脈血3～5 mL,析出血清后1 000×g離心,取上層血清保存于-80 ℃冰箱。取100 μL血清,按照miRcuteTMmiRNA提取分離試劑盒說(shuō)明書步驟提取總RNA。提取RNA方法為吸附柱法。使用紫外分光光度儀測(cè)定RNA純度,其D260/D280比值為1.8～2.2,計(jì)算RNA濃度用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

RNA逆轉(zhuǎn)錄應(yīng)用miRcuteTMmiRNA cDNA第一鏈合成試劑盒,在miRNA 3’末端加多聚A尾Poly(A),再使用oligo(dT)-universal tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),最終生成miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一鏈。取2 μg模板RNA加入0.4 μL大腸埃希菌Ploy(A)聚合酶、2 μL 10×大腸埃希菌Ploy(A)聚合酶緩沖液及4 μL 5×rATP溶液,用無(wú)RNase去離子水將總體系補(bǔ)至20 μL,置于37 ℃反應(yīng)60 min,完成miRNA 3’末端加Poly (A)處理。取2 μL前述Poly(A) 反應(yīng)液,加入2 μL 10×逆轉(zhuǎn)錄引物、2 μL 10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、1 μL超純dNTPs、1 μL RNase及0.5 μL定量逆轉(zhuǎn)錄酶,用無(wú)RNase去離子水將總體系補(bǔ)至20 μL,構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,于37 ℃反應(yīng)60 min。

miRNA檢測(cè)以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,miR-39為外參,應(yīng)用miRcuteTM增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。取2 μL miRNA第一鏈cDNA,加入10 μL 2×miRcute miRNA SYBR-ROX預(yù)混液,0.4 μL正向引物,0.4 μL反向引物,用無(wú)RNase去離子水將總體積補(bǔ)至20 μL,構(gòu)成實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。在ABI-7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成PCR擴(kuò)增。所有樣品均設(shè)3個(gè)副孔,取平均Ct值。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)熱2 min,94 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s共40個(gè)循環(huán)。

Ct值處理采用log10(2-ΔCt)法進(jìn)行表達(dá)水平分析。反應(yīng)體系中熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)為Ct,ΔCt=(Ct目的基因-Ct外參基因)。log10(2-ΔCt)為最終該樣本miRNA-767-3p的相對(duì)表達(dá)值。

血清CEA檢測(cè)使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀BioPlexTM2200,通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescent immunoassay,CLIA)法測(cè)定以上血清標(biāo)本的CEA濃度(ng/mL)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Stata 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。CRC組、CA組與NC組的年齡差異采用多樣本Kruskal-Wallis檢驗(yàn),性別差異采用Pearsonχ2檢驗(yàn)。CRC組、CA組與NC組的血清miRNA-767-3p表達(dá)值和CEA濃度采用多樣本Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。CRC患者miRNA-767-3p表達(dá)值與性別、腫瘤病變部位和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系使用成組t檢驗(yàn),與腫瘤TNM分期、病理分級(jí)的關(guān)系使用多樣本Kruskal-Wallis檢驗(yàn),與年齡、腫瘤直徑的關(guān)系使用Pearson線性相關(guān)分析。用構(gòu)建受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線及曲線下面積(area under the curve,AUC)評(píng)估m(xù)iRNA-767-3p、CEA及miRNA-767-3p聯(lián)合CEA的診斷效能。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

CRC組、CA組與NC組血清miRNA-767-3p水平和CEA濃度的比較CRC組患者血清miRNA-767-3p水平log10(2-ΔCt)的中位數(shù)為3.52,CA組為2.89,NC組為1.78。3組血清miRNA-767-3p水平呈依次遞減趨勢(shì)(圖1),3組血清miRNA-767-3p水平間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。3組進(jìn)行兩兩成組t檢驗(yàn)及Bonferroni校正,仍具有顯著差異。CRC組血清CEA濃度log10中位數(shù)為0.46,CA組為0.32,NC組為0.15,呈依次遞減趨勢(shì)(圖2)。

miRNA-767-3p水平與CRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系血清miRNA-767-3p水平在CRC組、CA組及NC組間的年齡存在顯著性差異(P<0.001),但miRNA-767-3p表達(dá)水平在CRC患者性別、病變位置、TNM分期、有否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)等5個(gè)病理參數(shù)組內(nèi)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。此外,CRC患者血清miRNA-767-3p水平與患者年齡相關(guān)系數(shù)為-0.040,F值為0.13,P值為0.716;與腫瘤直徑相關(guān)系數(shù)為0.021,F值為0.03,P值為0.854,表明CRC患者血清miRNA-767-3p表達(dá)水平與患者年齡和腫瘤直徑均無(wú)相關(guān)性。

圖1 CRC組、CA組及NC組的miRNA-767-3p水平Fig 1 miRNA-767-3p levels in CRC group,CA group and NC group

NS:Non significant.

圖2CRC組、CA組及NC組的CEA濃度
Fig2ConcentrationofCEAinCRCgroup,CAgroupandNCgroup

血清miRNA-767-3p和CEA檢測(cè)對(duì)CRC的診斷價(jià)值ROC分析結(jié)果顯示,CRC組miRNA-767-3p的AUC為0.770 (95%CI:0.698～0.842)。當(dāng)臨界閾值為0.49時(shí),約登指數(shù)最高,此時(shí)靈敏度為80%,特異度為68%。以≤5 ng/mL作為CEA的正常參考值,則CEA的靈敏度為29%,特異度為100%。若聯(lián)合測(cè)定miRNA-767-3p與CEA,AUC可達(dá)0.862 (95%CI:0.806～0.918),診斷靈敏度為73%,特異度為84%。聯(lián)合應(yīng)用診斷的計(jì)算公式為:0.788×miRNA-767-3p+3.289×CEA。miRNA-767-3p、CEA及miRNA-767-3p與CEA聯(lián)合應(yīng)用診斷CRC的ROC曲線見(jiàn)圖3。

ItemsExpressionofmiRNA-767-3pt/HPSex Male3.613±1.065t=1.190.119 Female3.348±0.914Location Left3.550±1.003t=-1.820.964 Right2.624±0.790TNMGrade Ⅰ4.050+1.057H=6.180.103 Ⅱ3.385±1.010 Ⅲ3.366±0.949 Ⅳ4.125±1.011LymphaticMetastasis yes3.587±1.039t=1.160.124 no3.325±0.960PathologicalGrade Ⅱ3.395±1.152H=0.520.771 Ⅱ-Ⅲ3.529±0.843 Ⅲ3.529±1.252

圖3miRNA-767-3p及CEA診斷CRC的ROC曲線
Fig3ROCcurvesofmiRNA-767-3pandCEAindiagnosisofCRC

討 論

miRNA-767有miRNA-767-3p和miRNA-767-5p兩種類型,已發(fā)現(xiàn)不同種屬生物中存在9種核苷酸序列形式,其中hsa-miRNA-767-3p通常被認(rèn)為是miRNA-767的代表。與其他miRNA不同,除了在腦組織和睪丸組織中表達(dá)遺傳表型調(diào)控作用之外,miRNA-767幾乎在所有成體正常組織中都呈完全沉默狀態(tài)[5]。黑色素瘤細(xì)胞系MEL和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系GLCPI中,miRNA-767-3p表達(dá)均有所增多[9]。

本研究表明,在CRC、CA患者和健康人血清中miRNA-767-3p水平呈依次遞減趨勢(shì),3組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NC組比較,CRC組miRNA-767-3p的AUC為0.770,靈敏度為80%,特異度為68%。一般認(rèn)為,AUC為0.5～0.7診斷價(jià)值較低,0.7～0.9診斷價(jià)值中等,0.9以上診斷價(jià)值較高。因此,單獨(dú)以miRNA-767-3p作為CRC的診斷標(biāo)志物具有中等診斷價(jià)值。miRNA-767-3p表達(dá)水平與CRC患者性別、年齡、腫瘤直徑、病變位置、TNM分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、腫瘤直徑等病理參數(shù)無(wú)關(guān),表明其可作為獨(dú)立的CRC診斷指標(biāo)。

CEA是目前臨床最常用的CRC腫瘤生物化學(xué)標(biāo)志物,被廣泛用于消化道腫瘤診斷,特別是腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)后評(píng)估,但存在靈敏度低,易受非特異性結(jié)腸炎、膠原性疾病、心血管疾病影響等缺點(diǎn)[10]。本研究以臨床上常用的<5 ng/mL作為血清CEA正常參考值時(shí),CEA靈敏度僅29%。相比于傳統(tǒng)的診斷標(biāo)志物以95%健康人群的取值范圍作為患病與否的臨床閾值,多種診斷標(biāo)志物聯(lián)合以及ROC曲線的應(yīng)用則大大提高了檢測(cè)的靈敏度和特異度。 miRNA-767-3p與CEA聯(lián)合后AUC可達(dá)0.862,約登指數(shù)可提高到0.57,表明miRNA-767-3p與CEA聯(lián)合可提升對(duì)CRC的診斷效能。

多項(xiàng)研究表明,聯(lián)合檢測(cè)血清中2種或2種以上高風(fēng)險(xiǎn)miRNA比檢測(cè)單一的miRNA診斷價(jià)值更高[11-12]。因此,在未來(lái)工作中可以檢測(cè)更多種類的miRNA,使miRNA-767-3p與其他miRNA聯(lián)合應(yīng)用,提高對(duì)CRC及其癌前病變的診斷效能,從而為CRC的早期診斷、早期治療和預(yù)后判斷提供新的研究方向和思路。

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