Tif1γ在胰腺癌細胞凋亡中的作用

(復旦大學附屬華東醫(yī)院普外科 上海 200040)

胰腺癌5年總生存率僅為5%,是預后最差的惡性腫瘤之一。吉西他濱(gemcitabine,GEM)是一種核苷酸還原酶抑制劑,是對中晚期胰腺癌進行抗代謝類化療的首選藥物,對人胰腺癌Capan-1細胞的IC50為559 μmol/L[1]。雷替曲塞(raltitrexed,RTX)是一種喹唑啉葉酸鹽類似物,通過抑制胸苷活性致DNA斷裂和細胞死亡,主要對晚期結直腸癌進行抗代謝類化療的治療,由于胰腺癌患者容易對GEM產(chǎn)生耐藥性而致使化療失敗,因此RTX近年來也開始應用于胰腺癌治療[2],對人胰腺癌Capan-1細胞的IC50是0.86 μmol/L[1]。

轉(zhuǎn)錄中介因子1γ(transcriptional intermediary factor 1 gamma,Tif1γ)又名TRIM33,是三重模體(tripartite motif,TRIM)蛋白家族成員之一。TRIM含有3 個保守結構域:環(huán)指(ring finger)、B 盒(B-box)以及卷曲螺旋(coiled coil)結構域,也稱RBCC 家族,是E3泛素連接酶的環(huán)指家族的成員,與腫瘤、炎癥和自身免疫疾病相關。Tif1γ為核蛋白,可與磷酸化的Smad2/Smad3競爭性結合Smad4[3],Tif1γ通過發(fā)揮其泛素連接酶活性使Smad4降解,并將Smad4從細胞核中遷移至細胞質(zhì),從而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),阻礙腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)移[4]。

本研究擬通過GEM與RTX兩種藥物分別處理人胰腺癌Capan-1細胞,通過檢測Tif1γ的表達量來評估藥物促進胰腺癌細胞凋亡的效力。

材 料 和 方 法

材料人胰腺癌細胞株Capan-1來自同濟大學附屬楊浦醫(yī)院中心實驗室,注射用鹽酸吉西他濱(以下簡稱GEM)購自美國禮來公司,注射用RTX(以下簡稱RTX)購自南京正大天晴公司,鼠抗人Tif1γ、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Smad4、Bcl2、BAX、Caspase3和GAPDH單克隆抗體購自美國CST公司。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司。BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。AnnexinⅤ-FITC /PI雙染凋亡試劑盒購自美國Beckman公司。

細胞培養(yǎng)和藥物處理人胰腺癌細胞株Capan-1用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。Capan-1細胞分別用559 μmol/L的GEM或0.86 μmol/L的RTX處理36 h,未用藥物處理的細胞設為對照。

細胞凋亡實驗培養(yǎng)36 h的Capan-1細胞和經(jīng)藥物處理36 h后的細胞分別用不含EDTA的胰蛋白酶消化,收獲細胞,用冷PBS洗2次,細胞沉淀重懸于100 μL AnnexinⅤ-FITC /PI雙染凋亡試劑盒中的結合緩沖液,加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI,室溫避光孵育15 min,再加400 μL結合緩沖液,用FACS Calibur流式細胞儀檢測10 000個細胞,監(jiān)測凋亡百分數(shù)。實驗重復3次,取均值。

Westernblot實驗收獲培養(yǎng)36 h的Capan-1細胞和經(jīng)藥物處理36 h后的細胞,用哺乳動物細胞總蛋白抽提試劑抽提細胞總蛋白,用BCA法進行蛋白質(zhì)定量,取等量總蛋白(每孔15 μg/5 μL)進行10% SDS-PAGE,然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,室溫下用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h,膜與1∶1 000稀釋的一抗于4 ℃孵育過夜,洗膜后與HRP標記的二抗于37 ℃溫育1 h,ECL顯色,采用ChemiDoc MP化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行圖像掃描,檢測蛋白質(zhì)與內(nèi)參GAPDH的灰度比值用以表示蛋白質(zhì)相對水平。

結 果

化療藥物對Capan-1細胞凋亡的影響流式細胞術檢測各組細胞凋亡率如圖1所示,圖1A為未進行藥物處理的Capan-1細胞,其中①、②和③分別代表死亡細胞與晚期凋亡細胞、早期凋亡細胞和活細胞。圖1B為GEM處理組,早期凋亡細胞為22.7%±3.9%,明顯多于RTX處理組與對照組,其中GEM處理組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(t=10.42,P=0.009 1,圖1D),RTX處理組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(t=8.709,P=0.012 9,圖1D),RTX處理組與GEM處理組之間差異無統(tǒng)計學意義(t=1.787,P=0.215 8,圖1D)。圖1C為RTX處理組,晚期凋亡細胞(28.7%±5.1%)及死亡細胞(3.7%±0.5%)明顯多于GEM處理組和對照組。RTX處理組的晚期凋亡細胞和死亡細胞與GEM處理組之間差異有統(tǒng)計學意義(t=8.927,P=0.012 3,圖1D),RTX處理組與GEM處理組之間差異有統(tǒng)計學意義(t=7.396,P=0.017 8,圖1D)。

A:Control;B:GEM;C:RTX;D:Statistic analysis.(1)P<0.01,(2)P<0.001.

圖1GEX和RTX作用36h對Capan-1細胞凋亡的影響
Fig1EffectsofchemotherapeuticsonapoptosisinCapan-1cellstreatedbyGEXandRTXfor36h

化療藥物對Tif1γ/TGF-β1信號通路蛋白質(zhì)水平的影響用Western blot方法測定化療藥物干預Capan-1細胞引起Tif1γ/TGF-β1信號通路中Tif1γ、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Smad4、Bcl2、BAX和Caspase3蛋白質(zhì)水平的變化(圖2)。RTX處理可引起Tif1γ、TGF-β1、Smad3、p-Smad3和Caspase3蛋白質(zhì)水平增高,分別是GEM組的1.4倍(P=0.002 8)、1.4倍(P=0.002 9)、1.2倍(P=0.028 7)、1.0倍(P=0.273 1)和1.2倍(P=0.000 2),是對照組的2.3倍(P=0.002 6)、1.4倍(P=0.011 8)、1.5倍(P=0.011 6)、1.4倍(P=0.016 0)和2.8倍(P=0.000 2),而Smad4蛋白質(zhì)水平降低,是GEM組的0.84倍(P=0.020 1),是對照組的0.83倍(P=0.014 1)。提示Smad4可能被Tif1γ降解。RTX處理可致Bcl2/Bax比值顯著降低(圖2C),是GEM組的0.86倍(P=0.043 7),是對照組的0.54倍(P=0.003 2)。

A:The levels of Tif1γ,TGF-β1,Smad3,p-Smad3,Smad4,Bcl2,BAX,Caspase3 and GAPDH in three groups were determined by Western blot,respectively.B:Western blot analysis of target proteins by mean grey values.C:Change of Bcl2/BAX in the course of drugs intervention.(1)P<0.05;(2)P<0.01;(3)P<0.001.

圖2Westernblot測定各組Capan-1細胞中Tif1γ/TGF-β1信號通路蛋白質(zhì)水平
Fig2ThelevelsofproteinsinTif1γ/TGF-β1signalingpathwayinCapan-1cellsdeterminedbyWesternblot

討 論

多聚線性泛素化(linear polyubiquitylation)是泛素化調(diào)控靶蛋白活性的重要形式,其中泛素連接酶E3 (ubiquitin ligase E3,UBE3)是核心環(huán)節(jié)。新近發(fā)現(xiàn),多聚線性泛素化在調(diào)節(jié)NF-κB 信號通路中具有重要作用。作為泛素連接酶E3 家族的主要成員,TRIMs 參與NF-κB 信號調(diào)節(jié),涉及多種腫瘤病理機制。泛素化(ubiquitylation,Ub)介導的蛋白質(zhì)水解途徑是一種翻譯后修飾過程,參與真核細胞多種生理和病理功能調(diào)節(jié)。UBE3 能夠特異性識別底物并確定泛素化拓撲,是多聚線性泛素化調(diào)節(jié)底物蛋白質(zhì)的穩(wěn)定/降解/活性的關鍵因子。多聚線性泛素化在NF-κB 信號通路激活調(diào)控中具有十分重要的作用。多聚線性泛素化機制能夠直接識別NF-kB 信號途徑的多個核心蛋白(如IκB、TRAF2/6、RIP1、HOIP、NEMO 等),參與信號活化調(diào)節(jié),涉及炎癥病理機制以及腫瘤炎癥微環(huán)境的調(diào)控[5-8]。TRIM是UBE3-RING主要家族成員。TRIM可經(jīng)泛素化調(diào)控NF-κB 信號途徑相關核心蛋白,參與多種腫瘤病理機制。TRIM44 通過上調(diào)lCXCL16 及MMP9 表達,激活NF-κB 信號通路,促進非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移及浸潤[9]。TRIM52 可以通過RING 結構域特異性激活NF-κB 信號途徑,TRIM52 過表達可以誘導TNFα和IL-6 表達,激活NF-κB 信號通路,對NF-κB 發(fā)揮陽性調(diào)節(jié)作用[10]。TRIM13 RING E3 連接酶可通過泛素化修飾調(diào)控NEMO,抑制INF 誘導的NF-κB 信號活化效應[11]。TRIM59 的B盒和環(huán)指結構域(UBE3)可與ECSIT 相互作用,過表達TRIM59 可抑制NF-κB 啟動子活化[12]。

NF-κB 介導的信號通路是腫瘤炎癥微環(huán)境的調(diào)節(jié)中樞[13-14]。NF-κB 屬于Rel家族的轉(zhuǎn)錄因子,在哺乳動物體內(nèi)NF-κB 分為5 種類型:RELA(P65)、RELB、C-REL、NF-κB1 (P105/P50)和NF-κB2 (P100/P52)。靜息狀態(tài)下,NF-κB以同源或異源二聚體形式存在,并與NF-κB 抑制子(inhibitor of NF-κB,IκB)形成穩(wěn)定的無活性復合物;活化狀態(tài)下,炎癥因子TNF-α、IL-6/8、LPS 等可激活IκB 激酶(IKKβ/ IKKγ),誘導IκB 與NF-κB 解體,NF-κB 進入細胞核內(nèi),與特定基因啟動子序列結合,啟動基因轉(zhuǎn)錄,誘導靶細胞炎性應答(TNF-α、IL-6/8、CXCLs、CCLs、TGF-β等)。這些炎癥因子升高又可反過來促使NF-κB活化,形成惡性循環(huán),放大了腫瘤炎癥反應損傷。

Tif1γ是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)通路中重要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子[15]。TGF-β屬于控制細胞增殖、分化、運動和凋亡的多肽超家族。TGF-β的Ⅰ型和Ⅱ型受體二聚體化后與TGF-β結合使Smad2和Smad3磷酸化,磷酸化的Smads與中介Smad4結合遷移至細胞核,Smads復合物可與不同的轉(zhuǎn)錄因子整合,調(diào)節(jié)控制癌細胞的增殖、代謝和轉(zhuǎn)移多個靶基因的表達[16]。Tif1γ可發(fā)揮降解Smad4的作用,多數(shù)來源于小鼠模型的數(shù)據(jù)顯示Tif1γ可發(fā)揮抑制腫瘤的作用[17]。本研究的Western blot結果顯示:RTX處理后,Capan-1細胞的Tif1γ蛋白質(zhì)水平明顯高于GEM處理組和對照組(P<0.01),而Smad4水平明顯低于GEM處理組和對照組(P<0.05),提示Tif1γ參與Smad4的降解,可能發(fā)揮抑制癌細胞轉(zhuǎn)移的作用,實驗結果與預期相符。

本研究的流式細胞術檢測結果顯示,Capan-1細胞經(jīng)RTX處理后,細胞晚期凋亡與死亡比例明顯高于GEM處理組和對照組(P<0.01);Western blot結果也顯示,RTX處理組Bcl2/Bax比值明顯低于GEM處理組和對照組(P<0.05),Caspase3蛋白質(zhì)水平明顯高于GEM處理組和對照組(P<0.001),細胞凋亡增加,與流式細胞術檢測結果一致。

胰腺癌是一種高度惡性腫瘤,目前僅15%～20%的胰腺癌患者可以接受手術治療,5年生存率僅為16.3%～28.9%,單純使用GEM治療的患者中位生存時間是5.6個月[18]。近年來,采用RTX聯(lián)合GEM區(qū)域性灌注治療胰腺癌可以提高患者生存率,中位生存時間達9.6個月[2]。由于GEM和RTX對不同的人胰腺癌細胞株的IC50濃度變化范圍較大[1],RTX是否在其他胰腺癌細胞株中有類似表現(xiàn),還需要后續(xù)實驗研究對RTX的促細胞凋亡效應進行進一步探討。

[1] MERCALLI A,SORDI V,FORMICOLA R,etal.A preclinical evaluation of pemetrexed and irinotecan combination as second-line chemotherapy in pancreatic cancer[J].BrJCancer,2007,96(9):1358-1367.

[2] 賈春怡,趙瑞峰.RTX聯(lián)合吉西他濱區(qū)域性灌注術治療胰腺癌療效觀察[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析,2016,16(1):24-25.

[3] YAN X,LIAO H,CHENG M,etal.Smad7 protein interacts with receptor-regulated Smads (R-Smads) to inhibit transforming growth factor-β (TGF-β)/Smad signaling[J].JBiolChem,2016,291(1):382-392.

[4] HESLING C,FATTET L,TEYRE G,etal.Antagonistic regulation of EMT by TIF1γ and Smad4 in mammary epithelial cells[J].EMBORep,2011,12(7):665-672.

[5] IWAI K,TOKUNAGA F.Linear polyubiquitination:a new regulator of NF-kappaB activation[J].EMBORep,2009,10(7):706-713.

[6] STIEGLITZ B,RANA RR,KOLIOPOULOS MG,etal.Structural basis for ligase-specific conjugation of linear ubiquitin chains by HOIP[J].Nature,2013,503(7476):422-426.

[7] FUJITA H,RAHIGHI S,AKITA M,etal.Mechanism underlying IkappaB kinase activation mediated by the linear ubiquitin chain assembly complex[J].MolCellBio,2014,34(7):1322-1335.

[8] LECHTENBERG BC,RAJPUT A,SANISHVILI R,etal.Structure of a HOIP/E2-ubiquitin complex reveals RBR E3 ligase mechanism and regulation[J].Nature,2016,529(7587):546-550.

[9] LUO Q,LIN H,YE X,etal.Trim44 facilitates the migration and invasion of humanlung cancer cells via the NF-kappaB signaling pathway[J].IntJClinOncol,2015,20(3) :508-517.

[10] FAN W,LIU T,Li X,etal.TRIM52:a nuclear TRIM protein thatpositively regulates the nuclear factor-kappa B signaling pathway[J].MolImmunol,2017,82:114-122.

[11] TOMAR D,SINGH R.TRIM13 regulates ubiquitination and turnover of NEMO to suppress TNF induced NF-kappaB activation[J].CellSignal,2014,26(12):2606-2613.

[12] KONDO T,WATANABE M,HATAKEYAMA S.TRIM59 interacts with ECSIT and negatively regulates NF-kappaB and IRF-3/7-mediated signal pathways[J].BiochemBiophysResCommun,2012,422(3):501-507.

[13] JUNG HY,FATTET L,YANG J.Molecular pathways:linking tumor microenvironment toepithelial-mesenchymal transition in metastasis[J].ClinCancerRes,2015,21(5):962-968.

[14] MIN C,EDDY SF,SHERR DH,etal.NF-kappaB and epithelial to mesenchymal transition of cancer[J].JCellBiochem,2008,104(3):733-744.

[15] LIGR M,WU X,DANIELS G,etal.Imbalanced expression of Tif1γ inhibits pancreatic ductal epithelial cell growth[J].AmJCancerRes,2014,4(3):196-210.

[16] HELDIN CH,MOUSTAKAS A.Role of Smads in TGFβ signaling[J].CellTissueRes,2012,347(1):21-36.

[17] HERQUEL B,OUARARHNI K,KHETCHOUMIAN K,etal.Transcription cofactors TRIM24,TRIM28,and TRIM33 associate to form regulatory complexes that suppress murine hepatocellular carcinoma[J].ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(20):8212-8217.

[18] LEWIS AR,VALLE JW,MCNAMARA MG.Pancreatic cancer:are “l(fā)iquid biopsies” ready for prime-time [J].WorldJGastroenterol,2016,22(32):7175-7185.