OsCRY基因融合蛋白的表達純化及多克隆抗體制備

莊春紅　莊偉建

摘 要：藍光受體隱花色素是主要的光受體之一，參與植物生長發育過程中一系列的生理生化及代謝反應。本研究克隆了OsCRY1a、OsCRY1b、OsCRY2全基因的末端400bp到600bp，構建了pET-29a（+）-OsCRY1a、pET-29a（+）-OsCRY1b、pET-29a（+）-OsCRY2基因高效表達載體，并在大腸桿菌中進行蛋白的誘導表達，分別獲得大約20-30kD的CRY融合蛋白，純化了CRY融合蛋白，并制備了多克隆抗體。

關鍵詞：隱花色素 融合蛋白 多克隆抗體

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：1003-9082（2018）01-0-02

光受體在植物的光形態建成中起重要作用，參與植物生長發育過程中一系列的生理生化及代謝反應[1]。隱花色素是在所有主要的演化譜系上基因表達光調節的藍光受體，但是其信號轉導的分子機制仍然還沒被完全揭示。光經過這些受體進行信號轉導，引起生理生化反應，抑制下胚軸伸長、調節開花時間、氣孔開放、刺激子葉擴展、引導晝夜節律時鐘和調節基因表達等[2]，進而調節植物的生長發育，以更好適應外界環境。本研究克隆了OsCRY1a、OsCRY1b、OsCRY2三個隱花色素基因末端400bp到600bp，構建基因高效表達載體，在大腸桿菌中誘導蛋白表達，純化出融合蛋白，制備多克隆抗體，為后續隱花色素基因的利用和改造奠定基礎。

一、材料與方法

1.材料

1.1菌種、質粒和培養基

大腸桿菌（ Escherichia coli）BL21和DH5α、質粒pET29a（+） 均由本實驗室保存。LB 培養基：10 g·L - 1蛋白胨， 5 g·L - 1 NaCl， 5 g·L - 1酵母粉，pH 7. 0； 120 ℃高壓滅菌20 min， 4 ℃保存備用。

1.2酶、生化試劑及試劑盒

Taq TM DNA聚合酶、膠回收試劑盒（ PCR Fragment Recovery Kit）及相關PCR引物購自上海生工生物工程有限公司，限制性內切酶和T4 連接酶購自大連TaKaRa公司 ；Kan（卡那霉素） 、Amp （氨芐青霉素）、PMSF（苯甲基磺酰氟）來自美國AMERSCO公司；瓊脂糖（Biowest agarose） 、質粒提取試劑盒（MediBEST Plasmid Purification Kit ）和Ni-NTA Superflow Cartridge購自Qiagen公司（上海） ；ECL檢測試劑盒、 NC （硝酸纖維膜） 轉印膜為GE 公司產品； IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）購自廈門星隆達化學試劑有限公司；弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑為北京鼎國公司產品；其余藥品為國產分析純生化試劑。

1.3實驗動物

3只大耳成人家兔，體重約2 kg。

2.方法

2.1日本晴水稻基因組DNA的提取

用CTAB法[3]提取日本晴水稻基因組DNA。

2.2表達載體構建

以含有CRY1a、CRY1b、CRY2粳稻日本晴基因組DNA模板，Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1為引物，PCR 擴增獲得目的片段，回收產物經Nde1和 Xho1、Nde1和Eag1、Nde1和Xho1雙酶切后連入pET29a（+）表達載體，轉入大腸桿菌DH5α，重組質粒鑒定后，送上海生工生物工程有限公司測序。引物序列如下：

Oscry1acctpET-Nde1： 5acta-CATATG-gactcct ccgacgtgcc gccgat 3

Oscry1acctpET-Xho1： 5acta-CTCGAG-GCCTTCTCTCCCAGTCCAGTTGCT 3

Oscry1bcctpET-Nde1： 5 Caac-CATATG-tcctcggag gttccaccaattg 3

Oscry1bcctpET-Eag1： 5Atta-CGGCCGa-CCAAACTGGGACTACGCCTC 3

Oscry2cctpET-Nde1： 5cgac-CATATGa-cagaatggat tcatcatcca tg 3

Oscry2cctpET-Xho1： 5 ctta-CTCGAG-TGCGGCTTTTCGTTGTCTTGA 3

2.3 融合蛋白的表達

將表達載體pET29a（+）-cry1a、pET29a（+）-cry1b、pET29a（+）-cry2轉化大腸桿菌BL21表達菌株[4]，在平板（50 μg/mL Kan+）上篩選，挑取單克隆菌落，培養至對數生長期，測其OD值為0.5，加入IPTG誘導。4℃，5000rpm，離心10分鐘，收集菌體，棄上清。1 mL 菌液沉淀用100μL上樣緩沖液 （50mmol/Ltris-HCL（pH6.8）、 100mmol/L 二硫蘇糖醇、2%SDS （電泳級）0.1%溴酚藍、10%甘油） 重懸，煮沸4分鐘，離心后上清液，多克隆抗體在12%SDS-PAGE中分離檢測[5] 。

2.4融合蛋白的親和純化收集

100 mL 誘導表達后的菌體，離心收集沉淀。每克大腸桿菌中加3mlNPI-10（50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑，pH8.0）或Buffer B（8mol/L尿素、100mmol/L NaH2PO4、100mmol/L Tris·Cl，pH8.0）重懸沉淀，低溫超聲破碎。每克菌加入8ul 50mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）和8ul溶菌酶（10mg/ml），在4℃下20min內不時地進行攪拌。一邊繼續攪拌一邊在每克大腸桿菌中加入4mg去氧膽酸[6]。放置懸浮液于37℃并用玻棒不時地攪拌。當裂解物變粘稠時，在每克大腸桿菌中加入20ul 核酸酶（1mg/ml），室溫（25℃）貯藏直至裂解液不再粘稠。離心后，將上清載入Ni-NTA瓊脂糖親和層析柱，用5倍柱體積NPI-20（50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑，pH8.0）或Buffer C（8mol/L尿素、100mmol/L NaH2PO4、100mmol/L Tris·Cl，pH6.3）沖洗3-5遍，再用NPI-250（50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑，pH8.0）或Buffer E（8mol/L尿素、100mmol/L NaH2PO4、100mmol/L Tris·Cl，pH4.5）洗脫。最后收集洗脫組分，利用12%SDS-PAGE 進行分離檢測。

2.5多克隆抗體的制備

將100?g抗原/兔溶入1ml磷酸緩沖溶液中待用并加入1ml弗氏不完全佐劑溶液，劇烈震蕩使之充分乳化，用5ml注射器抽取該乳化液，接上25G針頭，排除注射器中的氣泡。將兔子放在平坦處，在4個不同的部位進行皮下注射，兩處在后背，兩處在大腿處[7]。在4個不同部位分別各注射約500?l抗原溶液。4-6周后再次注射抗原，并在注射后的7天-10天，每只兔子耳緣靜脈取血0.5～1 mL，分離抗血清。[8]

二、結果與分析

1.三個CRY基因PCR擴增

以日本晴基因組DNA為模板， Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1為引物進行PCR擴增，產物經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶，且大小與預測基因一致，用膠回收試劑盒回收目標條帶。

2.三個CRY基因表達載體的構建

質粒pET-29a（+）和目的片段酶切連接后，轉化大腸桿菌DH5α。挑選單克隆進行振蕩培養后，分別以Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1為引物進行PCR擴增，篩選正確的克隆子。提取PCR檢測陽性的克隆子重組質粒，以Nde1和 Xho1、Nde1和Eag1、Nde1和Xho1進行雙酶切驗證（圖1）。結果顯示，三個重組質粒的雙酶切產物經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測均有雙條帶，且大小與預期結果一致。重組質粒上海生工生物工程有限公司測序，測序結果與已報道序列一致。

3.重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達

三個重組質粒轉化大腸桿菌BL21，轉化菌培養至細胞密度（OD600）為0.5-0.6，加入終濃度為0.7 mmol·L - 1 IPTG進行誘導培養3-4小時。誘導后的細菌細胞煮沸后12% SDS-PAGE電泳，顯示如圖2。誘導后融合蛋白大小均在20-30KD，連接6個His標簽。

4.融合蛋白的分離純化

利用Qiagen公司的Ni-NTA Sp in Column進行三個CRY融合蛋白的分離純化。用pH 7. 4的0. 05 mol·L - 1磷酸鹽緩沖液（含0 - 0. 5 mol·L - 1咪唑）的進行梯度洗脫[9]，收集純化的重組CRY蛋白，經SDS-PAGE檢測 （圖3）。純化蛋白條帶單一，其純度高，可用于多克隆抗體的制備。

5.多克隆抗體特異性分析

將制備的多克隆抗體稀釋7500倍，以CRY1a、CRY1b、CRY2融合蛋白為抗原（100ng）進行包被，三種多克隆抗體分別作為一抗，ELISA檢測顯示三種多克隆抗體分別有反應，且有交叉反應。以CRY1a、CRY1b、CRY2融合蛋白作為抗原（100ng），用三種多克隆抗體（1：500，1：2000，1：2000）進行點雜交，發現融合蛋白只與對應多克隆抗體有反應，證明由此方法得出結果的多克隆抗體特異。

三、結論

本研究構建了pET-29a（+）-OsCRY1a、pET-29a（+）-OsCRY1b、pET-29a（+）-OsCRY2三個高效表達載體，并在大腸桿菌中His誘導融合蛋白表達，分別獲得大約20-30kD的CRY融合蛋白，并利用His標簽純化出特異的融合蛋白，免疫家兔后可獲得較為特異的多克隆抗體。本研究為隱花色素轉基因水稻的功能驗證奠定基礎，以期進一步深入了解水稻隱花色素基因各自的功能。

參考文獻

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作者簡介：莊春紅，福建惠安，漢族，1988年2月出生，微生物學碩士研究生，主要研究方向微生物方向。