雷竹PvJ3基因克隆及功能分析

陳曉沛，施 泉，郭小勤，曹友志，徐英武

（浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州311300）

開花是高等植物進入生殖生長的標志，是植物完成生活史的必要環節。在擬南芥Arabidopsis thaliana中的研究發現，開花過程受多種內源因素和外源環境因素的影響，由復雜基因網絡嚴格調控［1］。光周期途徑中植物開花受季節性晝長變化影響［2］；赤霉素（GA）途徑是在非誘導光周期途徑的條件下，在開花過程中發揮作用［3］；春化途徑中植物開花要受到低溫積累的影響［4］；自主途徑中通過感知植物自身內部發育狀態而調控植物開花［5］，多種途徑的成花調節信號最終都集中于2個整合因子：開花促進因子FLOERING LOCUS T（FT）和 SUPPRESSPR OF OVEREXPRESION OF CONSTANS 1（SOC1）［6-8］。 在擬南芥中，過表達FT基因會明顯促進SOC1基因的表達量；同時在ft突變體中，SOC1的表達量明顯下降［9-11］，但是對ft和soc1雙突變體與ft單突變體植株的開花時間進行統計，結果顯示沒明顯差異，可知除FT蛋白調控SOC1的表達外，還存在另外的途徑影響SOC1基因的表達［10-13］。其他開花控制因子可以通過FT和SOC1參與開花途徑的調控，例如開花抑制因子SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）可以結合SOC1和FT的調控序列，對FT和SOC1產生抑制作用［14］，進而下調它們的表達量。近年，發現擬南芥中屬于J蛋白家族一員的J3蛋白，可以與SVP蛋白相互作用調控SOC1和FT基因的表達量，而實現對成花信號的調節，在調控開花途徑中發揮著十分重要的作用［15］。 J蛋白（J-domain protein）是廣泛存在于動植物中的一個龐大的分子伴侶家族，該類蛋白N末端包含1個約由70個氨基酸構成的保守序列——J結構域而被命名為J蛋白［16-17］。J蛋白的J結構域由4個α-螺旋組成，第2和第3個螺旋之間有一個極為保守的由組氨酸、脯氨酸、天冬氨酸組成的HPD三肽，這是J結構域的重要特征［18］；鄰近J結構域的是G/F結構域（富含甘氨酸和苯丙氨酸）；之后是鋅指結構域。根據結構域的不同J蛋白可分為4類［19］：Ⅰ類J蛋白包含所有常見的結構；Ⅱ類J蛋白缺少鋅指結構；Ⅲ類J蛋白只有J結構域；Ⅳ類J蛋白也被稱作J-like蛋白，這類蛋白的J結構域沒有HPD模塊［20-21］。目前發現擬南芥中共有120個J蛋白，其中Ⅰ類J蛋白8個，Ⅱ類J蛋白16個，Ⅲ類J蛋白92個，Ⅳ類J蛋白4個［22］。在植物中，有關J蛋白的研究主要集中在擬南芥中，現有的結果表明，J蛋白可以參與多種生物學過程，包括葉綠體的發育［23-25］、植物的抗逆性［26-27］、信號轉導［28-29］和成花途徑［15］等。在擬南芥開花調控中，J3蛋白通過與SVP等其他開花關鍵因子相互作用而影響植物成花過程，SVP的突變體svp-41表現為早花現象，J3的突變j3-1表現為晚花現象，同時在j3-1和svp-41的雙突變體中，擬南芥表現出早花現象，與svp-41的單突變體的表型相似，這一結果表明J3基因通過與SVP的相互作用實現對開花時間的調控［30-31］，進一步研究發現在細胞核中J3基因通過與營養生長短期（SVP）蛋白直接相互作用，衰減SVP蛋白與SOC1和FT調控序列的結合從而上調SOC1和FT基因的表達量［15］。竹類植物開花周期較長并具有時間上的不確定性，而且很多竹子開花后會成片死亡，雷竹Phyllostachys violascens是一種優良的筍用竹種，近年來，雷竹普遍開花，開花后部分雷竹會死亡，導致雷竹筍產量大幅度下降，帶來嚴重的經濟損失。有關竹類植物開花的研究已經很多，但是竹子成花機制和花期調控模式至今尚未完全清楚［32］。目前，竹子中還未見有關J3基因生物學功能的研究，本研究以雷竹為研究對象，通過同源克隆技術獲得1個J3同源基因，經過亞細胞定位、表達模式和功能分析，以期能為深入研究J3同源基因在竹類植物開花調控機制中的作用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雷竹材料來源于浙江農林大學智能溫室大棚，選取位于同一竹鞭上的筍、花芽、花，開花和不開花雷竹的幼葉、成葉、莖稈，標記分裝后放入液氮中速凍，保存在-80℃超低溫冰箱。

1.2 核糖核酸（RNA）的提取及互補脫氧核糖核酸（cDNA）的合成

用全 RNA提取試劑盒（鼎國）分別提取采集的雷竹材料的RNA，以提取的RNA（少于0.5 g·L-1）為模板，用Prime ScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒（Clontech），反轉錄獲得雷竹各組織的cDNA，檢測合格后，于-20℃保存備用。

1.3 目的基因的克隆及序列分析

通過本地Blast，從毛竹Phyllostachys edulis基因組文庫中找到一個候選基因序列號（bphylf027h21），根據該候選基因的基因序列設計引物（J3，表1），雷竹cDNA為模板，進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增條帶，用膠回收試劑盒（上海生工生物公司）回收純化電泳條帶，將獲得的目的片段與pMD19（simple）-T載體置于連接儀上16℃連接1.0～3.0 h，之后轉化大腸埃希菌 Escherichia coli DH5α感受態細胞（熱轉化法），37℃恒溫培養箱培養6.0～8.0 h，挑取白色圓形單菌落，菌落PCR鑒定出陽性單克隆，送測序，得到堿基序列。

用Vector NTI預測基因序列的開放閱讀框（ORF）區，據此設計引物（PvJ3，表1），重復上述實驗過程，最終測序得到雷竹PvJ3基因序列。運用TMHMM和ProtScale分析PvJ3蛋白的結構特征和理化性質；Smart在線分析其蛋白的結構域；通過Clustal X2比對雷竹PvJ3與其他物種中的J3同源基因的氨基酸序列的相似性；并用Mega 5.0構建系統發育樹，選擇鄰近法（NJ），bootstrap回復次數為1 000次。

1.4 組織特異性表達檢測

用雷竹各組織部位的cDNA為模板，通過實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR），分析雷竹PvJ3基因的表達模式。根據實驗要求設計目的基因的定量引物（PvJ3-1，表1），毛竹的PeNTB基因作為內參基因［33］。各種雷竹組織做3次重復，避光條件下操作，參照SYBR Premix Ex TaqTMII（Takara）試劑盒要求加樣。PCR擴增程序（兩步法）：預變性95℃，5 min；95℃，30 s；60℃，30 s，循環數為40。反應結束后，分析確定數據的可靠性，選擇合適的數據，用2-ΔΔCT方法［34］對數據進行分析。

1.5 亞細胞定位

根據PvJ3基因ORF區序列（不含終止密碼子）和pCaM35S-sGFP載體序列上的酶切位點，在目的基因ORF區的上下游分別引入酶切位點SmaI和BamHI，設計引物（PvJ3-2，表1），提取pMD19-PvJ3質粒做為模板，進行PCR反應，膠回收純化得到帶有酶切位點的基因片段與pMD19（simple）-T載體連接轉化后，陽性單克隆送測序。將測序正確的單克隆進行擴大培養，用質粒提取試劑盒（上海生工生物公司）提取質粒，用限制性內切酶SmaI和BamHI分別對pMD19-PvJ3和pCaM35S-sGFP載體質粒進行雙酶切實驗，之后用T4 DNA連接酶在16℃條件下過夜連接膠回收的酶切產物，連接產物轉化大腸埃希菌DH5α感受態細胞，經測序正確，瞬時表達載體PvJ3-GFP構建成功。通過基因槍轟擊洋蔥Allium cepa表皮，25℃下避光暗培養1～2 d后，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號，金粉的準備和樣品的制備參照文獻［35］。

1.6 構建轉基因過表達載體

根據PvJ3基因ORF區序列和pC1301載體（含有35 S啟動子）的序列設計引物（PvJ3-3，表1），在目的基因ORF區的上下游同樣分別引入酶切位點SmaI和BamHI，構建過表達載體pC1301-PvJ3，實驗方法參照1.5節。

1.7 擬南芥轉基因植株檢測

通過熱轉化法將構建成功的pC1301-PvJ3過表達載體轉入農桿菌Agrobacterium tumefaciens GV3101感受態細胞中，提取陽性單克隆的質粒，重新轉化大腸埃希菌DH5α感受態細胞，再次測序檢驗轉入重組質粒是否正確。用已正確轉入pC1301-PvJ3重組載體的農桿菌配制侵染液，侵染進入花期的野生型擬南芥花序［36］，侵染3次，間隔約1周·次-1，侵染后的擬南芥即T0代植株，將消毒處理后的T0代種子均勻撒在加入潮霉素的1/2 MS（Murashige and Skoog）固體培養基上，潮霉素質量濃度為100.00 mg·L-1，按照V（潮霉素溶液）∶V（1/2MS培養基）=1.50∶1 000.00比例加入培養基中，篩選抗性植株，以采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法［37］提取的抗性植株的基因組 DNA為模板，PCR鑒定出T1代陽性植株，并對植株表型進行初步統計。

表1 本研究所用的引物Table 1 PCR primers used in this study

2 結果與分析

2.1 基因的克隆和序列分析

根據在毛竹轉錄組數據庫中挑選的基因設計引物，利用同源克隆的方法，從雷竹中分離得到1個J3同源基因，命名為PvJ3，分析PvJ3基因的堿基序列，可知，其ORF區由1 260 bp個堿基組成，能編碼419個氨基酸。經蛋白結構域和氨基酸序列分析（圖1～2），可知PvJ3蛋白的N端有J蛋白家族典型的J結構域，同時具有鋅指結構域，C末端有法尼基化信號CAQQ序列。用ClustalX2軟件對不同物種的 J3同源蛋白的氨基酸進行序列比對，結果發現：J3蛋白在各類物種中的相似性很高，與擬南芥J3蛋白的一致性可達80.90%（圖2）。采用臨近法構建系統進化樹，結果顯示：雷竹J3蛋白與單子葉植物高粱Sorghum bicolor和玉米Zea mays的親緣關系最近，水稻Oryza sativa，大麥Hordeum vulgare和小麥Triticum aestivum次之，與雙子葉擬南芥和亞麻薺Camelina sativa的親緣關系最遠（圖3）。

圖1 PvJ3蛋白結構示意圖Figure 1 Structure diagram of PvJ3

2.2 組織特異性表達分析

通過qRT-PCR技術，對同一竹鞭上開花和不開花雷竹中PvJ3基因在不同組織部位的表達水平進行分析。結果表明：PvJ3基因在同一竹鞭的筍、花芽、花，開花與不開花的莖稈、成葉、幼葉中均有表達。在開花雷竹的莖稈中PvJ3基因的表達量最高，莖、花芽、花、幼葉和成葉中的表達依次降低。在不開花雷竹的莖稈中PvJ3基因的表達量同樣也是最高，幼葉、成葉中表達量基本一樣（圖4）。

2.3 亞細胞定位結果分析

用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞，通過熒光顯微鏡觀察瞬時表達載體PvJ3-GFP綠色熒光蛋白的信號，確定PvJ3蛋白的定位情況（圖5）。pCaM35S-GFP對照在整個洋蔥細胞里均有熒光信號，而PvJ3-GFP在細胞質核細胞核里有熒光信號，因此推斷PvJ3蛋白主要定位在細胞質和細胞核中。

2.4 PvJ3基因在擬南芥中的過量表達分析

構建過表達載體pC1301-PvJ3轉化野生型擬南芥收取T0代種子，潮霉素篩選抗性植株，以抗性植株基因組DNA為模板，經PCR檢測得到T1代擬南芥共37株。觀察統計T1代植株中長勢較好的30株轉基因植株的表型，發現PvJ3基因的過表達植株開花時間明顯早于野生型（圖6B）。統計結果顯示：轉基因植株開花天數比野生型植株顯著提早（P＝6.51E-15＜0.01），平均提早3.50 d（圖6C），開花時蓮座葉數目比野生型植株顯著減少（P＝9.24E-09＜0.01），平均減少4.43葉（圖6D），且表現出多主莖現象（圖6A）。

3 討論

高等植物成花過程存在多種誘導途徑，大量基因參與這些途徑的調控，成花關鍵基因的研究對于開花過程及花發育調控有著重要意義［38］。擬南芥中研究發現，SOC1和FT是感知不同開花途徑信號的整合因子，SVP是直接調控 FT和 SOC1的轉錄調控因子［8,39］，J3蛋白通過與SVP直接相互作用而衰減SVP與SOC1和FT調控序列的結合從而上調SOC1和FT的表達量，參與擬南芥的成花過程，這一發現使得擬南芥成花調控網絡更加完善［15］。本研究成功從雷竹中克隆得到J3同源基因并命名為PvJ3，雷竹PvJ3所編碼的氨基酸序列與擬南芥J3蛋白氨基酸序列一致性達80.90%，對其蛋白結構域分析可知，PvJ3擁有相對保守的J結構域以及鋅指結構域，可以說明PvJ3屬于J家族中的一員。

為了研究雷竹PvJ3蛋白的功能，本研究通過qPCR技術和亞細胞定位分析該蛋白在雷竹中的表達模式和表達部位。對雷竹PvJ3基因進行了不同組織部位特異性表達分析，結果顯示雷竹PvJ3基因在同一竹鞭的不同組織部位都有表達，已發現雙子葉植物擬南芥J3基因同樣在根、莖、葉、花芽、花和果莢等不同組織中表達［29］，說明J3基因在單雙子葉植物中均表現出全株表達的現象。在相對表達量上，PvJ3基因在開花雷竹莖稈中表達量最高，在花芽和花中的表達量降低，這與已報道的擬南芥中J3基因在花中表達量最高［15］的結果存在差異。PvJ3蛋白亞細胞定位結果顯示該蛋白定位在細胞質和細胞核，與擬南芥中J3蛋白的亞細胞定位結果相一致［15］，擬南芥中和J3蛋白具有互作關系的SVP，SOC1和FT蛋白都是核蛋白，說明雷竹PvJ3可能在細胞核中與這些開花整合因子相互作用，從而對開花途徑進行調控。

圖2 PvJ3與其同源基因的氨基酸序列比對Figure 2 Alignment of the PvJ3 amino acid sequences from different plant species

將PvJ3基因導入野生型擬南芥植株驗證其功能，T1代轉基因植株的表型統計結果表明：轉基因擬南芥植株開花時間明顯早于野生型植株，開花時蓮座葉數量明顯減少（圖6 C，圖6D），而擬南芥J3基因的過表達植株和野生型植株的開花時間并沒有明顯差別［15］，這說明雷竹PvJ3基因可以顯著影響花期，可能是一個開花促進因子。值得注意的是，轉雷竹PvJ3基因擬南芥植株同時表現出多主莖現象（圖6A），這一現象在擬南芥J3過表達植株中并沒有被觀測到［15］。 以上結果表明， 雷竹PvJ3基因不僅在成花調控中的功能和擬南芥J3基因存在一定差異，同時還可能參與莖的發育等其他生長發育過程，在基因功能上比擬南芥同源基因要復雜的多。

圖3 不同物種J3蛋白的系統進化樹分析Figure 3 Phylogenetic tree analysis of J3 in different plant species

目前，J3基因功能的有關研究主要以模式植物擬南芥為研究對象，單子葉植物中還未見報道。通過對比J3基因在雷竹和擬南芥中的表達模式不難發現：雷竹PvJ3基因和擬南芥J3基因都是全株表達，同時編碼蛋白都定位在細胞質和細胞核，這表明J3基因在不同植物中的表達部位不存在明顯差異，并且可能是一個核內作用蛋白。在相對表達量上，雷竹PvJ3基因和擬南芥J3基因存在一定差異，同一竹鞭上開花和不開花雷竹中PvJ3基因在莖稈中表達量最高，而擬南芥中J3基因表達量在花中最高，這可能與雷竹PvJ3基因參與莖的發育有關。轉基因實驗的結果表明：雷竹PvJ3基因不僅可以顯著提早擬南芥開花時間，同時還促使擬南芥出現多主莖現象，這表明雷竹PvJ3基因很可能參與除了開花調節以外的其他生長發育過程的調控。由于擬南芥和竹子之間的差異很大，雷竹PvJ3基因在竹子中是否可以促進植物提早開花，同時還參與哪些生物學過程，需要后續研究進一步驗證。

圖4 PvJ3在開花雷竹與不開花雷竹的不同部位表達水平Figure 4 Expression of PvJ3 in different tissues of Phyllostachys violascens

圖5 PvJ3蛋白亞細胞定位結果Figure 5 Subcellular localization of PvJ3 fusion protein

圖6 PvJ3過表達擬南芥T1植株表型Figure 6 Phenotypes of the PvJ3 transgenic Arabidopsis thaliana in T1generation

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