桂花EST-SSR引物開發及在品種鑒定中的應用

李 軍，董 彬，張 超，付建新，胡紹慶，趙宏波

（1.浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州311300；2.浙江理工大學 建筑工程學院，浙江 杭州310000）

桂花Osmanthus fragrans在中國栽培歷史悠久，栽培區域廣闊，是中國最重要的集綠化、美化和香化為一體的傳統名花和園林樹種之一［1-2］。桂花野生資源豐富，現已明確的有150多個品種［3-4］，這為桂花種質創新和新品種的選育提供了豐富的遺傳變異和優異的基因庫［5］。分子標記是進行品種鑒定和親緣關系分析、分子輔助育種、遺傳多樣性和繁育系統研究等最常用的技術手段，通常需要有共顯性、多態性高、重復性好的引物，因此引物開發顯得極其重要［6］。簡單重復序列（simple sequence repeats,SSR）是由幾個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列［7］，目前，已經報道的桂花SSR引物十分有限，僅ZHANG等［8］開發了29對桂花SSR引物，馬寅峰［9］經過篩選獲得20對具有多態性的SSR引物，急需開發更多的特異性和多態性高的SSR引物用于桂花遺傳分析和品種鑒定等相關研究。表達序列標簽-簡單重復序列（expressed sequence tag SSR，EST-SSR）技術可避免基因組SSR開發過程中需要構建基因組DNA文庫等繁瑣步驟，可為功能基因提供可靠的標記，能夠充分反映基因組功能區域的相似程度。目前，EST-SSR標記也成為了遺傳多樣性和品種親緣關系研究的重要手段［10］。最優的SSR-PCR反應體系和條件，對樣本DNA所擴增條帶的數量、清晰度以及穩定性甚為重要，進而影響條帶多態性的統計與分析［11］。轉錄組數據是EST-SSR開發利用的有效資源，本研究首先對桂花SSR反應體系進行了優化，同時以不同野生桂花種群為材料，利用桂花轉錄組數據庫大量篩選EST-SSR引物，開發多態性高的EST-SSR引物，并利用篩選得到的引物進行品種鑒定，促進EST-SSR標記技術在桂花種質資源評價和保護、品種鑒定和遺傳多樣性分析等方面的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本包括浙江龍泉、浙江千島湖、福建長汀、福建清流、湖南郴州、湖南株洲、貴州瑞安、江西九江等8個桂花野生種群，浙江農林大學桂花資源圃地的7個丹桂品種，以及采自四川農科院園藝所的待鑒定品種。所有樣本材料均采集桂花新生枝上第4片完全展開葉，硅膠干燥后，放置-20℃冰箱備用。

SSR-PCR反應用的Taq酶，dNTP，鎂離子（Mg2+），PCR緩沖液（buffer），電泳用的10×TBE緩沖液，50×TAE溶液的相關藥品，無水乙醇，冰乙酸，瓊脂糖，丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，溴酚藍，6×上樣緩沖液（loading buffer），標準分子量DNA標準物（marker）等均購自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測 本研究采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取桂花DNA［12］，用Nano-Drop1000全自動核酸蛋白快速測儀和質量濃度為1.2%瓊脂糖凝膠電泳以及紫外凝膠成像系統檢測DNA純度、濃度和質量。從8個桂花野生種群中隨機各選取3份樣本DNA作為SSR-PCR反應的模板DNA，選擇福建官坊居群中的E4模板DNA用于體系優化以減少模板變化影響體系優化的效果。將所有模板DNA稀釋到試驗所需的100 mg·L-1，-20℃保存備用。

1.2.2 正交試驗體系優化 以桂花E4為DNA模板，在20 μL的PCR體系中，除2 μL 10×PCR緩沖液外，其他因素采用L16（45）正交試驗設計，對模板DNA含量、Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶單位數進行5因素4水平梯度試驗，共16個正交設計組合（表1），以確定最佳的桂花ESTSSR 反應體系［13］。

1.2.3 PCR擴增及凝膠電泳 利用Biometra PCR儀（德國）進行PCR擴增反應，反應程序如下：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，不同退火時間（TM）為30 s，72℃延伸30 s，循環數35；72℃延伸7 min。擴增產物利用體積分數為8%非變性聚丙烯酰胺凝膠［28 mL雙蒸水，8 mL體積分數為40%丙烯酰胺，4 mL 10×TBE，320 μL體積分數為10%過硫酸銨，40 μL四甲基乙二胺（TEMED）］電泳檢測，以DNA marker B作為參照；電泳儀（北京市六一儀器廠，DYCZ-6C型）電壓160 V，電流200 mA，電泳100min，然后用銀染法顯示擴增條帶。小心拆取凝膠后，依次浸入到固定液及染色液中（20 mL體積分數為10%乙醇，體積分數為0.5%冰乙酸1 mL，硝酸銀0.2 g，蒸餾水180 mL），置于搖床上震蕩染色12～15 min；去離子水漂洗30 s；顯色液（2 g氫氧化鈉，0.04 g四硼酸鈉、0.6 mL甲醛、200 mL蒸餾水）充分震蕩12～15 min，直至條帶完全顯色。利用凝膠成像系統拍照記錄結果，統計并分析擴增條帶的多態性。1.2.4 引物篩選 從桂花轉錄組EST-SSR引物序列數據庫中隨機挑選150對引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其詳細信息參見表2。利用優化后的最佳反應體系和條件，以8份桂花野生種群的基因組DNA作為模板，對150對SSR引物進行初次篩選，12 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳進行擴增產物的有效性檢測；再以24份基因組DNA（3份·種群-1）對初篩獲得的引物進行復篩，80 g·L-1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行多態性檢測，最終獲得多態性高、重復性好、穩定性高的SSR引物。

表1 EST-SSR正交試驗設計L16（45）Table 1 EST-SSR orthogonal experimental design L16（45）

1.2.5 多態性引物在品種鑒定中的應用 隨機挑選3對具有顯著多態性的SSR引物，以浙江農林大學桂花苗圃的7個丹桂品種為參照，對四川省常見栽培的14份丹桂樣本（SC01～SC14）進行品種鑒定（表3）。1.2.6 數據分析 根據條帶遷移情況統計目標范圍內出現的條帶，不同大小的條帶分別用 “A，B，C，D…”進行分類標記，純合子帶型記為 “AA，BB，CC，DD，…”，雜合子標記為 “AB，AC，BD，AD，…”，將帶型數據輸入POPGENE 1.32軟件計算遺傳距離，然后利用SPSS 19.0的歐氏平均聯接法繪制聚類樹狀圖。

表2 150對隨機引物信息表Table 2 Random primers information of 150 pairs

表3 品種鑒定材料信息表Table 3 Material information for cultivars

2 結果與分析

2.1 桂花SSR-PCR反應體系優化

以OF6220-2799擴增結果為例，在SSR-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果中，組合8，14，16的擴增條帶較弱，其余組合都能擴增出較為清晰的條帶，其中組合4的條帶最為明亮（圖1）。參照正交試驗各試劑的濃度和用量，最終確定桂花EST-SSR最優PCR反應體系為：DNA 40 ng，Mg2+2.25 mmol·L-1， 引物 0.3 μmol·L-1，dNTPs 0.3 mmol·L-1， TaqDNA 聚合酶 1.25 ×16.67 nkat， 并加入 2 μL 10 × PCR 緩沖液， 雙蒸水（ddH2O）補充至 20 μL。

圖1 正交試驗擴增結果Figure 1 Amplification results of orthogonal design

2.2 基于桂花轉錄組的EST-SSR引物篩選

利用優化后的PCR反應體系和條件，對隨機選取的150對EST-SSR引物進行初步篩選，共有79對引物擴增出特異性產物，有效擴增率為52.67%，在對應的SSR中，最多的為三、六核苷酸和復合重復類型，最少的為單核苷酸和四核苷酸重復類型（表4）。

表4 150對隨機EST-SSR引物擴增情況Table 4 EST-SSR amplification of 150 primers

以8個不同野生種群的24份桂花基因組DNA為模板，對初篩所獲得的79對引物進行復篩。最終篩選出19對穩定性好、多態性高的引物，占引物總數的12.67%，其中，五核苷酸重復對應的引物多態性最高（25.00%），其次分別為六核苷酸（19.44%）和三核苷酸（16.67%），在單核苷酸和二核苷酸重復類型中沒有發現多態性引物（表4）。篩選得到的19對引物中除了OF8091-2000，OF8233-681，OF10275-1164，OF21405-424在種群內擴增的多態性條帶不明顯外，其余的15對引物在種群內均能夠擴增出豐富的多態性條帶（圖2）。

2.3 多態性引物在桂花品種鑒定中的應用

利用篩選到的多態性較高的OF8623-1677，OF24299-844，OF28774-2088 3對引物對供試品種進行鑒定（表5）。擴增結果顯示：每對引物都可以產生1或2個等位基因，并且都可以將所有桂花樣本有效區分，所有已知桂花品種均有各自獨特的帶型或帶型組合（表6）。

從品種聚類樹狀圖（圖3）可以看出：在相對距離為12的時候，21份供鑒定樣本可聚為4類。首先，‘上海丹桂’和 ‘橙紅丹桂’分別單獨聚為一類（Ⅰ和Ⅱ），因為這2個品種在3對引物中的帶型均比較特別，表現出明顯的差異性；第Ⅲ類中，包含了 ‘朱砂丹桂’和大部分的成都來源的樣本，其中除了SC07和SC12在引物OF24299-844中未擴增出條帶外，這12份樣本在3對引物中均表現出與 ‘朱砂丹桂’一致的帶型，可以判斷這些樣本為 ‘朱砂丹桂’；第Ⅳ類中，包含了剩余的4個已知品種和2種待鑒定樣本。在相對距離為6時，可將第Ⅳ類分為2組：a組，SC06先與 ‘堰虹桂’聚為一小支，再與‘武夷丹桂’聚為一支，SC06與 ‘堰虹桂’在帶型上完全一致的，可判斷彭州市來源的丹桂為 ‘堰虹桂’；b組， ‘滿條紅’和 ‘狀元紅’先聚為一小支，再與SC08聚為一支，說明SC08與 ‘滿條紅’和‘狀元紅’親緣關系較近。

圖2 部分EST-SSR引物復篩電泳結果圖Figure 2 A part of EST-SSR primers screening electrophoresis figure for the second time

3 結論與討論

建立穩定可靠的SSR-PCR反應體系是EST-SSR分子標記開發和利用的基礎，SSR體系優化的方法有單因素試驗、完全試驗或正交試驗［14］。單因素試驗不能保證各最佳組分的組合即為最佳的反應體系；完全試驗卻存在試驗組合繁多，工作量大，試驗周期長等弊端［15-17］；正交試驗設計則是僅選用幾個具有代表性的處理組合進行試驗，結果分析簡便直觀，可操作性強［18］。袁存權等［19］利用L16（45）正交試驗設計對刺槐Robinia pseudoacacia的相關序列擴增多態性聚合酶鏈式反應（SRAP-PCR）體系中的主要成分進行的優化，楊傳平等［20］也成功利用L16（45）正交試驗設計，優化并建立了一套適用于白樺Betula platyphylla的SSR-PCR反應體系。本研究也利用了正交試驗設計，優化并建立了適合桂花的SSR-PCR反應體系。

表5 3對桂花EST-SSR引物序列Table 5 Three EST-SSR primer sequences of Osmanthus fragrance

表6 品種鑒定帶型信息統計表Table 6 Cultivars with type information statistics

圖3 歐氏平均聯接法生成的21份桂花樣本的聚類樹狀圖Figure 3 Dendrogram of cluster analysis of 21 Osmanthus fragrans cultivars produced by euclidean average connection method

不同植物的多態性SSR核苷酸重復類型具有很大的差異［21］，在蠟梅Chimonanthus praecox中，李響等［22］共從120對引物中篩選獲得17對優良的EST-SSR引物，篩出率為14.17%，主要包括二、三和六核苷酸重復類型；徐陽等［23］以杉木Cunninghamia lanceolata為材料，從10個EST-SSR和8個基因組SSR（gSSR）中各篩出4對多態性引物，多態率分別為40.00%和50.00%，所有核苷酸重復類型均有出現。本研究以桂花轉錄組數據庫為基礎，從完全隨機選取的150對EST-SSR引物中篩選出19對具有穩定多態性的引物，多態性比例為12.67%。其中，五核苷酸（25.00%）、六核苷酸（19.44%）和三核苷酸（16.67%）重復類型的多態性較高，充分說明可以利用桂花的轉錄組數據庫大規模進行桂花EST-SSR引物的開發。

SSR分子標記已經很好地應用于品種鑒定和親緣關系分析、遺傳多樣性、交配系統等研究。胡菀等［5］利用SSR分子標記對7個野生桂花群體139個個體的遺傳多樣性和遺傳結構進行了研究，并通過STRUCTURE聚類分析得到不同野生居群間具有較豐富的遺傳多樣性；ZHANG等［8］開發并獲得了29對具有高度多態性的SSR引物，對野生桂花種群和桂花品種分類鑒定進行了相關遺傳研究。野生桂花遺傳變異豐富，本研究以分布距離相對分散的野生桂花為模板篩選得到的引物，具有很強的研究價值，再利用篩選到的3對高度多態性的EST-SSR引物將遺傳差異較小的7個已知丹桂品種進行有效地區分，鑒定了來自于四川成都的14份丹桂樣本。結果表明：四川常見的栽培丹桂品種大部分為 ‘朱砂丹桂’，來源于彭州市丹桂SC06為 ‘堰虹桂’，而來源于新都區的SC08與 ‘滿條紅’和 ‘狀元紅’親緣關系較近。EST-SSR來源于基因的編碼區，與功能基因緊密連鎖，并且EST的高度保守性使得EST-SSR在同物種的不同品種間乃至不同物種間具有較高的通用性，所以可以對決定重要表型性狀的等位基因進行直接鑒定［24-25］。本研究利用桂花轉錄組開發獲得的EST-SSR引物在桂花品種鑒定中具有可靠性和適用性，可為后期桂花遺傳多樣性和親緣關系以及遺傳連鎖圖譜的構建等研究奠定基礎。

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