食源性細菌耐藥性檢測方法的研究進展

張可欣

李忠海1, 2

任佳麗1, 2

(1.中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.稻谷及副產品深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004)

隨著臨床、畜牧業和養殖業對抗生素的濫用，導致世界范圍內細菌對抗生素耐藥問題日益嚴峻[1]。這些食源性耐藥細菌有可能通過食物鏈將耐藥性基因傳遞給人類，從而引起人類的感染。中國動物性食品源細菌耐藥情況已很嚴重[2-4]。在中國，每年因食源性細菌感染發病人數可達9 411.7 萬人次，病死人數8 564人，病死率0.009 1%[5]。為了從源頭阻止污染耐藥性細菌的食品流入市場，感染人類，快速測定食源性細菌的耐藥性顯得尤為重要。目前常用的藥敏試驗方法有擴散法和微量法等，但傳統方法得到準確報告所需的時間太長，隨著分子生物學和電化學技術等學科的發展，一些新型的快速藥敏試驗方法得到了發展。本文擬對目前常用的藥敏試驗方法和快速藥敏試驗方法的研究進展進行闡述。

1 常規藥敏試驗方法

1.1 擴散法

擴散法是利用待測藥物在含菌平板上球形擴散的原理，離紙片(牛津杯或者孔)越近，抗生素濃度越高，越遠抗生素濃度越低，隨著抗生素濃度的降低，有一條最低抑菌濃度帶，過夜培養后細菌不能生長，形成抑菌圈。紙片擴散法是通過測量抑菌圈的大小并根據CLSI(Clinical and laboratory standards institute)制定的“抗微生物藥物敏感性試驗執行標準”來判斷細菌對該種抗生素的敏感程度。擴散法包括紙片法、牛津杯法和打孔法[6]。由于牛津杯法和打孔法的操作性和穩定性較差，且難以實現標準化，所以目前大多數實驗室和臨床藥敏試驗都采用紙片擴散法來獲得定性的結果。梁麗紅等[7]使用紙片擴散法調查食用鹵制品中倫敦沙門菌的藥敏；王萍等[8]使用紙片擴散法了解急性腹瀉患者副溶血性弧菌的耐藥情況。開發新的藥敏試驗方法中，也常與紙片擴散法的結果作對照，來保證新方法的準確有效性，如廖詩英等[9]在研究雞大腸桿菌TTC快速藥敏試驗方法過程中，選用紙片擴散法作為標準對照方法。

這種方法具有操作簡便，成本低廉等優點，但至少需要16～18 h的培養時間才能得到結果，且因為試驗結果容易受到諸多因素，例如pH、平板厚度等的影響，所以必須嚴格按照CLSI的操作章程試驗，同時使用質控菌株進行平行試驗。

1.2 稀釋法

稀釋法判斷細菌藥物敏感性的原理是根據細菌在一系列含有二倍稀釋濃度抗生素的培養物中的生長情況，肉眼觀察無明顯細菌生長的培養器中所含藥物的最低濃度就是最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。MIC值越小，說明細菌對該種抗生素越敏感。根據培養物的不同分為肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法，根據培養物量的不同，又分為常量法和微量法[10]。稀釋法可以得到對臨床用藥有指導意義的MIC值，可以在定性的同時又定量。李月婷等[11]使用微量肉湯稀釋法對食源性沙門菌進行藥敏試驗，結果表明27株受試沙門菌全部對頭孢西丁敏感；肖丹等[12]和李順姬等[13]使用微量肉湯稀釋法分別研究了沙門氏菌和致瀉大腸桿菌的耐藥性，結果表明66株沙門菌和41株致瀉大腸桿菌對測試的8種抗生素均有不同程度的耐藥，MIC值為4～608 μg/mL 不等。

稀釋法可以同時試驗多種菌，對抗生素的選擇也比較自由，是臨床中常用的藥敏試驗方法，但該方法同紙片擴散法一樣，也需要將試驗菌和質控菌進行平行試驗，當質控菌的結果符合標準，試驗菌的結果才可靠，且該方法至少需要16～20 h才能得到結果，且MIC值的準確判斷對操作人員的要求較高。

1.3 Etest法

Etest法是濃度梯度瓊脂擴散試驗，既結合了擴散法和稀釋法的特點和原理，又彌補了二者的不足[14]。E試條一面固定有不同濃度的藥物，另一面標有藥物濃度的刻度，將E試條含有藥物的一面置于含菌平板上過夜培養后，在試條周圍可見明顯的橢圓抑菌圈，通過讀取圈邊緣與E試條相交的刻度可以得到抗菌藥物抑制細菌的最小抑菌濃度。沈赟等[15]同時使用微量肉湯稀釋法和Etest法判斷食源致病菌的MIC值，結果表明2種方法重復性好；秦思等[16]使用Etest法對江蘇地區食源性致病菌進行耐藥分析，結果表明63株金黃色葡萄球菌對紅霉素耐藥率最高，為33.3%，多重耐藥率為3.2%；Cantón等[17]同時使用微量肉湯稀釋法和Etest 法對金黃色葡萄球菌進行藥敏試驗，結果表明2種方法具有良好的重復性。

Etest法繼承了紙片擴散法優點的同時，也具有定量的優點，與微量肉湯法相比，MIC值易判讀。以上3種傳統藥敏試驗方法都是基于細菌生長的原理，需過夜培養，獲得試驗結果所需時間較長。

2 快速藥敏檢測系統

目前有3種常用的藥敏自動檢測系統，分別是德國西門子的MicroScan WalkAway系統、法國梅里埃的Vitek系統和美國BD公司的Phoenix系列自動化儀器[18]。3種檢測系統都是基于微量肉湯稀釋法的原理，集成了標準濃度細菌懸液的配制、接種、培養、菌株生長情況測定及報告MIC值5個步驟于一體，具有快速、便攜的優點[6]。

孫宏莉等[19]調查中國425所使用Vitek-2藥敏檢測系統的醫院微生物實驗室的測試準確率，結果表明中國Vitek-2細菌藥敏檢測系統中氨芐西林/舒巴坦、頭孢替坦、頭孢曲松、美羅培南和頭孢吡肟的藥敏檢測結果一致性和準確性較低，其他抗菌藥物的藥敏結果均具有很好的一致性和較高的準確性；魏丹丹等[20]將臨床分離的可疑耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)124株隨機分別用Vitek-2 COMPACT和MicroScan WalkAway 40 SI全自動微生物鑒定儀進行細菌鑒定及藥敏分析，同時用PCR方法對照，評價2臺細菌分析儀檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的靈敏度、特異度和符合率，結果表明2臺全自動微生物分析儀與PCR方法檢測得到的結果一致；Erika等[21]用MicroScan方法測定了柬埔寨人血液中沙門氏菌對阿奇霉素和環丙沙星的耐藥性。

藥敏自動檢測系統的優點是在藥敏結果的數據報告、分析及傳遞方面的便捷性及準確性，減少了人力，缺點是儀器體積龐大不便攜，且購買儀器所需的費用昂貴，加上維修成本高導致使用成本高。

3 輔以顯色劑的藥敏試驗方法

具有代謝活性的細菌能產生ATP、水解酶以及氧化還原酶，創造出利于還原的環境，能夠直接或者間接地還原顯色劑，顯色劑顏色或者熒光的改變代表了細菌的活性[22]。細菌與抗生素以及反映代謝活性的顯色劑(如亞甲基藍和刃天青)一同培養，耐藥細菌會持續繁殖、代謝顯色劑導致顏色變化，而敏感細菌則不會，以此來判斷細菌的藥物敏感性。林麗英等[23]研究亞甲基藍還原法測定結核分枝桿菌的藥物敏感性，并將結果與傳統的絕對濃度法進行比較，2種方法測得MIC值的相同率較高；孫懷昌等[24-26]研制出一種以刃天青為指示劑的微量板，能夠快速診斷奶牛乳腺炎葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌的藥敏試驗，在12 h內獲得與紙片擴散法一致的藥敏試驗結果；Deiss等[27]研制出一種以刃天青為指示劑的便攜式大腸桿菌藥敏試驗紙板，具有與紙片擴散法類似的性能、重復性和預測性；Kadlec等[28]基于手機攝像頭將其改造成微光度計，研制出一種以水溶性四唑鹽(WST-8)為指示劑的快速便攜藥敏試驗方法，通過調整細菌與WST-8的作用時間可以直接測定初始濃度101～106CFU/mL 的細菌，省略了菌液的前處理步驟，將抗生素預涂于容器表面，也解決了有限資源下快速藥敏試驗的問題。

這種基于指示劑顏色變化來判斷細菌藥物敏感性的方法不僅可以肉眼觀察進行定性檢測，也可以使用分光光度計進行定量檢測，具有直觀，操作簡單的優點，可以縮短藥敏試驗的時間，但人工肉眼判別具有一定的主觀性，而分光光度計又不便于攜帶。

4 電化學方法

近年來，在細菌的電化學超靈敏檢測中已有了最新進展[29-31]，但只有學者研究抗生素敏感性的直接電化學檢測。電化學方法檢測細菌藥物敏感性的原理是：細菌的呼吸作用主要依靠呼吸鏈的電子傳遞，巧妙引入氧化還原探針介入細菌呼吸鏈，呼吸鏈活動產生的電化學變化可以用電化學的方法快速而可靠地檢測到。

國外已有此類研究。Ertl等[32-33]利用鐵氰化鉀作為氧化還原探針，將大腸桿菌與抗生素作用15 min后，與鐵氰化鉀的溶液混合，用計時電量法測定電信號，結果與傳統紙片擴散法完全一致，這種方法能在少于25 min的時間內提供報告，但用電化學方法測得的IC50值比標準濁度法得到的結果要高100倍，且試驗過程中發現電極對抗生素有吸附作用，影響試驗結果；Chotinantakul等[34]在Ertl等的基礎上，改進了試驗方案：大腸桿菌與細菌作用后離心除去抗生素，之后重懸于含有鐵氰化鉀的測試液中，該方法能在3～6 h給出藥敏試驗結果。

以上的研究均基于大電極系統，隨著微機加工技術的發展，電極尺寸可微縮至微米乃至納米級別，為便攜式耐藥細菌快速檢測系統的研制提供了技術支撐。Besant等[22]將菌液體積限制在2.75 nL的容器中，通過使用電化學檢測刃天青的還原來檢測細菌代謝活性，提出了一種快速電化學藥敏試驗方法能夠在1 h內報告細菌的藥物敏感性；Choi等[35]使用了一種微流體瓊脂糖系統(MAC)，通過瓊脂糖固定單個細胞后，使用顯微鏡觀察在不同抗生素存在時的生長情況，只需3～4 h就能給出與CLSI相匹配的MIC值。中國的何佳芮[36]研究構建了一種集細菌快速檢測和快速藥敏分析為一體的微流控芯片，能夠在30 min內完成對1 μL樣本中E.coliO157：H7的檢測，檢測限為101～105CFU/μL，并在4～8 h 完成對不同濃度下，3種抗生素的藥敏試驗。

電化學方法具有快速、靈敏、低能耗和低成本的優點，在開發快速便攜的藥敏試驗方法方面具有廣闊前景。

5 分子生物學技術

分子生物學技術包括PCR技術、基因芯片法、全基因組測序等[37]。運用分子生物學技術進行藥敏試驗，主要是從基因層面對耐藥基因進行的檢測。

5.1 PCR技術

PCR技術包括普通PCR和實時熒光定量PCR(Real-time PCR)[38]，可以用于鑒定和定量分析臨床標本中的病原菌，以及檢測病原菌中的耐藥基因，具有靈活、快速的優點[39]。目前，已經可以通過PCR技術檢測mecA和(或)mecC基因來鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)[40]；還有人[41-42]運用PCR技術通過檢測與萬古霉素耐藥基因相關的vanA和vanB基因來快速檢測腸球菌的耐藥性。李堅等[43]設計并合成熒光定量PCR引物，繪制熒光定量PCR標準曲線，以熒光定量PCR方法測定細菌在抗生素作用下生長不同時間基因組DNA含量，并與紙片(K-B)法進行比較，建立了葡萄球菌快速藥敏試驗方法，結果與紙片擴散法一致。

5.2 基因芯片技術

基因芯片的測序原理是雜交測序法，即未知序列通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，具有快速、特異、高通量的特點，運用該技術檢測細菌耐藥性，可以在1個工作日內提供報告[37-38]。歐維正等[44]通過比較基因芯片法和比例法在檢測結核分枝桿菌對利福平和異煙肼的藥物敏感性試驗中的符合率，發現基因芯片較比例法有更高的敏感性和特異性，對多重耐藥性結核桿菌的快速診斷具有重要臨床價值；Naas等[45-46]的研究表明，在最新的升級版芯片中可一次性檢測3種超廣譜β內酰胺類耐藥基因，6種質粒介導的頭孢菌素類耐藥基因和5種碳青霉烯類耐藥基因，經臨床菌株驗證顯示，敏感性和特異性均為100%。

5.3 全基因組測序

全基因組測序可以得到樣品的完整序列，可獲得大量信息。朱健銘等[47]運用全基因測序法分析肺炎克雷伯菌JM45株對喹諾酮類藥物耐藥基因；王登峰[48]基于Hiseq 2000和PacBio SMRT技術的測序數據，使用de novo拼接方法獲得多重耐藥MRSA菌株Z35和Z43的全基因組序列并進行SCCmec特征分析，結果顯示Z35為ST9-SCCmec Ⅶ，攜帶重組酶基因復合體ccrC2；Z43為ST97-SCCmec Ⅳ，含有多種耐藥基因。

分子生物學方法與傳統藥敏試驗法不同，傳統藥敏試驗方法是對菌株耐藥表型的檢測，而分子生物學方法是基因層面對耐藥基因進行的檢測[6]。PCR技術檢測耐藥基因具有快速靈敏度高的特點，但一次檢測的耐藥基因有限，且容易出現假陰性結果；基因芯片法能一次檢測多種耐藥基因，具有快速、靈敏度高和特異性高的特點，但在檢測新的或不典型的耐藥基因時具有局限性，且價格昂貴；全基因組測序能夠發現盡可能多的耐藥機制，是細菌耐藥機制研究的重要手段，但不適合臨床和耐藥性檢測、監測中的推廣應用[49]。以上3種分子生物學方法都不能對臨床治療提供有指導意義的MIC值[37]。

6 展望

以快速、靈敏和便攜的耐藥細菌鑒定技術可有效避免污染食品的進一步流通，是研究的方向和熱點。傳統藥敏試驗方法作為“金標準”，具有完善的標準體系，但所需時間長(通常24～48 h)；快速藥敏檢測系統減少了人工操作，但儀器龐大且成本較高，難以做到便攜；分子生物學技術具有高通量、快速和特異性高的特點，但在檢測新的和不典型耐藥基因時具有局限性；基于電化學方法的微流控技術具有快速、靈敏、微型的特點，如能突破穩定性和可回復性因素的影響，將是未來生物檢驗發展的方向。

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