凝結芽孢桿菌益生機制及應用研究進展

郭慶豐，陳林，*，馬經緯

（1.黃河科技學院，河南鄭州450063；2.鄭州市藥用資源研究重點實驗室，河南鄭州450063）

益生菌是指一類服用足夠數量能夠對宿主健康有益的活性微生物，其主要作用在于其進入腸道后能夠維持腸道菌群的平衡，促進有益菌的繁殖和抑制致病菌生長，因此對人體健康有益[1-2]。凝結芽孢桿菌既能像乳酸菌和雙歧桿菌具有益生作用，又具有芽孢菌的抗逆性強、耐高溫高壓和易貯藏等優點，能夠改善腸道菌群結構、調節腸道功能紊亂、維持腸道內菌群平衡和提高機體免疫水平、促進營養物質代謝和利用，是近年來研究的熱門菌種。本文主要對凝結芽孢桿菌概況、生物學特性、益生作用機理、安全性、微生態制劑及臨床應用研究等方面進行綜述。

1 凝結芽孢桿菌概況

1915年，Hammer[3]首次從凝結的變質牛奶中分離出凝結芽孢桿菌（B.coagulans），1932 年，Sarles等[4]對凝結芽孢桿菌進行了詳細描述，同年，Horowitz-Wlassowa和Nowotelnow首次用芽孢乳酸菌（Lactobacillus sporogenes）來描述凝結芽孢桿菌，由于其含有乳酸菌和芽孢桿菌的雙重特性，其分類一直存在爭議，直到第八版的《伯杰氏鑒定細菌學手冊》（Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology）將接觸酶陽性的，嗜熱的乳桿菌歸于芽孢桿菌屬，將其重新分類，統一規范命名了凝結芽孢桿菌[5]。凝結芽孢桿菌在1989年被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）評為“普遍認為安全”的一類桿菌，此外該菌被評價為缺乏產毒潛能，獲得了歐洲歐盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）的安全資格認定（Qualified Presumption of Safety，QPS）[6-7]。該菌在日本、美國、歐洲等地已經被應用于藥品、食品和飼料添加劑等行業[8-11]。我國農業部亦于2004年在第372號公告中，批準了天津市新星獸藥廠將凝結芽孢桿菌TQ33作為仔雞和生長育肥豬的食品添加劑的申請[12]。2005年，由青島東海藥業有限公司生產的凝結芽孢桿菌活菌片，也獲得國家食品和藥品監督管理局新藥證書[13]。

2 凝結芽孢桿菌生物學特性

凝結芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，屬厚壁菌門，營養細胞呈桿狀，兩端鈍圓，單個、成對、少數呈短鏈狀，芽孢端生，無鞭毛，最適生長溫度為45℃～50℃，最適pH為6.6～7.0，其能分解小分子糖類生成L-1乳酸，為同型乳酸發酵菌，過氧化氫酶陽性[14-15]。凝結芽孢桿菌除具有和乳酸菌及雙歧桿菌同樣的保健功效外，還具有耐胃酸、耐熱、耐膽堿鹽、降解亞硝酸鹽、容易培養和保存等特點。趙虎山等[11]發現凝結芽孢桿菌TQ33經90℃，60 min濕熱和120℃，60 min干熱處理，其活菌數只下降1個數量級；將其置于pH大于2.42的酸性溶液中，存放1年后，其存活率仍高達105；凝結芽孢桿菌NJ102在pH 2.5的模擬胃液中處理12 h，存活率為71.9%。在膽鹽濃度0.3%和pH 8.0的模擬腸液中處理12 h，存活率為84.4%，該菌可有效降解亞硝酸鹽，48 h降解率達到96.8%[16]。

3 益生作用機理

凝結芽孢桿菌作為益生菌中的一種，目前還未見其益生作用機制的確切報道，不過學者普遍認為其在腸道中所起的生理調節功效并非單一物質的作用，而是其分泌多種代謝產物以及與腸道其它益生菌協同作用的結果。

3.1 調節消化道微生態平衡

凝結芽胞桿菌是一種兼性厭氧菌，能適應腸道內低氧環境，進入腸道后，在腸道內定植，通過消耗游離氧，抑制需氧型有害菌的生長，同時促進厭氧益生菌如乳酸菌、雙歧桿菌等的增殖；產生乳酸降低腸道pH值，并分泌多種抗菌的細菌素類多肽物質如凝固素等，能夠抑制腸道有害菌的生長，從而有效恢復并維持腸道微生態平衡，進而提高生物體免疫力，減少腸道疾病的發生。除此之外，它能產生雙乙酰、有機酸等多種代謝產物，減少胺類等有害物質的產生，不僅能改善腸道內微生態環境，同時也改善體外環境，從而減少疾病的發生與傳播[17-18]。

3.2 促進機體對營養物質的消化吸收

凝結芽孢桿菌可以通過3種方式促進機體對營養物質的吸收利用。一是促進產生多種消化酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-半乳糖苷酶及乳酸脫氫酶等有助于提高胃腸道對食物消化，降解難以被宿主消化的復雜碳水化合物，如果膠、葡聚糖、乳糖、纖維素和木聚糖等[19-23]；二是在腸道內生長、繁殖和定植后，其自身能直接產生多種營養物質供機體吸收利用，如氨基酸、維生素、短鏈脂肪酸和促生長因子等，它們同其它益生菌協同作用促進小腸蠕動，改善腸道功能，從而促進機體對營養物質的消化與吸收；三是可以通過產生乳酸促進動物機體對鐵、磷、鈣和維生素D等的吸收[12-13]。

3.3 提高免疫力，增強抗病力

益生菌能夠提高免疫系統的免疫能力，增強吞噬細胞的活性，增加胃腸道等器官對病原微生物的抵抗能力[24-26]。體外試驗表明，凝結芽孢桿菌的發酵上清液及細胞壁成分可通過調節細胞因子、抑制活性氧和增強細胞吞噬作用來提高腸道免疫能力，另外凝結芽孢桿菌能促進消化道粘膜發生免疫反應[27-28]。Baron等[29]研究證明，凝結芽孢桿菌GBI-30能夠提高T細胞中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量，可用來防治腺病毒和甲型流感病毒等特定病毒感染。王文杰等[30]發現，凝結芽孢桿菌TBC169能顯著提高免疫功能低下小鼠的免疫功能，減少正常小鼠腸道中胺和氨的含量，從而增強機體抵抗力和保護機體。

4 安全性

益生菌一直被認為是安全的，但也有研究發現益生菌能造成宿主機體感染，產生有害代謝產物，產生過度的免疫反應以及引起耐藥基因的轉移等，給一些人群帶來安全隱患，并且臨床上也出現了服用益生菌制劑致病的案例[30]。不過歐洲食品安全局認為凝結芽孢桿菌是對所有抗生素都是敏感的，不攜帶耐抗生素基因；毒理學安全性實驗表明，凝結芽孢桿菌沒有無致誘變，致畸變以及遺傳毒性效應。Endress等[31-32]報道，凝結芽孢桿菌對大鼠的急性和90 d的亞慢性口服毒性實驗結果顯示其無明顯毒害劑量為1 000 mg/（g·d），活菌濃度為1.36×1011CFUs/g，相當于平均重70 kg，其安全口服劑量為95.2×1011CFUs。為了進一步研究凝結芽孢桿菌安全性，他們又對其進行了長達一年的慢性口服毒性聯合繁殖毒性研究，其結果表明凝結芽孢桿菌沒有對大鼠親代及其子孫顯示任何毒性。且對于一個70 kg的人來說，長期每天攝入量為9.38×1010CFUs的凝結芽孢桿菌是安全的。

Majeed等[33-34]發現凝結芽孢桿菌MTCC 5856不會像其他芽孢桿菌一樣產生腸毒素，也不含有腸毒素基因，沒有明顯的細胞毒性，且不會產生誘變效應，能夠在常溫下存活3年。凝結芽孢桿菌在烘焙食品、飲料、植物油、濃縮糖漿甚至煮咖啡中都非常穩定。

凝結芽孢桿菌的代謝產物中具有廣譜抗菌效果的多肽類細菌素物質，通過MTT實驗證明沒有明顯細胞毒性，且能夠被蛋白酶水解[35-36]。

5 凝結芽孢桿菌在微生態制劑方面的應用

微生物菌劑是指利用益生菌的生長及其代謝產物制成的活菌制劑，具有調整維持動物腸道微生態平衡、促進機體胃腸道吸收、提高免疫力的作用。凝結芽孢桿菌由于具有抗逆性強、耐高溫高熱、易貯藏等特性，能順利通過胃酸和消化酶的雙重作用進入腸道定植，并在腸道迅速復蘇成為活菌，發揮其對動物腸道的保健作用，凝結芽孢桿菌這些特性決定了其作為一種微生態制劑在水產養殖及家禽養殖方面有很好的應用前景。

5.1 凝結芽孢桿菌制劑在水產養殖方面的應用

在水產養殖中，水產動物代謝物以及養殖水體的富營養化問題日趨嚴重，各種有害物質或有機物在養殖水體中大量積累富集[37]。利用抗生素防治病害是最直接有效的方法，然而抗生素會產生耐藥性以及對養殖水體造成污染。高密度養殖模式導致抗生素濫用和殘留禁用抑菌試劑對水產養殖的健康發展造成了嚴重危害。益生菌能夠抑制有害菌并優化水體菌群結構達到水體內生態平衡，已被廣泛應用于水產養殖[38]。

凝結芽孢桿菌能夠分解養殖水體中的大分子有機物，并大量消耗水體中的有機物轉化為無機鹽從而改良水質，且可以為單細胞藻類提供營養[39]。藻類的光合作用為微生物和水產動物的呼吸提供氧氣，達到養殖水體的良性循環，使水體中的致病菌得到抑制[40]，既解決了水產動物酶制劑易失活和熱穩定性差的缺陷，又有效抑制了抗藥性的產生。因此，凝結芽孢桿菌應用于水產養殖能夠減少甚至消滅水產養殖動物病害的發生，最終提高水產品品質。

國外有研究表明，芽孢桿菌能夠增加腸粘膜的厚度、腸絨毛的高度和密度，進而有效促進腸道發育[41]。袁豐華等[42]將凝結芽孢桿菌添加在尖吻鱸的飼料中連續投喂50天后，尖吻鱸的增重率提高了9.45%。匡群等[43]在團頭魴養殖飼料中單獨添加凝結芽孢桿菌，團頭魴的特定生長率、蛋白質效率、腸道凝結芽孢桿菌數量和蛋白酶活力顯著提高，飼料系數和腸道大腸埃希菌數量顯著降低。張維娜等[44]將不同含量的凝結芽孢桿菌添加到異育銀鯽幼魚飼料中發現添加0.3%凝結芽孢桿菌可較好地促進異育銀鯽幼魚的生長，提高機體免疫力。在飼料中添加0.3%、0.5%凝結芽孢桿菌能夠顯著提高魚體的增質量率、特定增長率、肝臟的總抗氧化能力及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性，并能夠顯著降低餌料系數；添加0.5%凝結芽孢桿菌能顯著提高堿性磷酸酶、谷草轉氨酶活性及總蛋白質含量；添加0.3%凝結芽孢桿菌能顯著降低堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶活性；添加0.1%凝結芽孢桿菌能顯著降低堿性磷酸酶活性，顯著提高肝臟的過氧化氫酶活性。汪波等[45]將凝結芽孢桿菌添加至凡納濱對蝦幼蝦飼料中飼養20 d發現隨著凝結芽孢桿菌添加量的增加，試驗組凡納濱對蝦的增質量率和特定生長率增高，同時顯著降低餌料系數，提高養殖的存活率，超氧化物歧化酶和堿性磷酸酶活性增加。說明添加凝結芽孢桿菌可在一定程度上提高凡納濱對蝦幼蝦的生長性能和改善其非特異性免疫力。

5.2 凝結芽孢桿菌制劑在家禽養殖方面的應用

研究表明凝結芽孢桿菌制劑對家禽動物雞、豬等的生長性能、機體免疫功能也具有比較顯著的影響。趙娜等[46]對凝結芽孢桿菌對肉雞的生長性能、免疫器官指數、血清生化指標及腸道菌群的影響進行研究，結果顯示，飼糧中添加凝結芽孢桿菌可抑制肉雞腸道中大腸桿菌的生長，提高免疫器官指數，降低死淘率。黃世猛等[47]發現凝結芽孢桿菌可改善蛋雞生產性能和蛋品質，在蛋白質代謝、脂質代謝、肝功能和鈣磷吸收上都具有一定程度的改善作用。高書鋒等[48]研究發現飼糧中添加0.15%凝結芽孢桿菌制劑可提高斷奶仔豬生長性能、降低糞樣致病菌數量、提高糞樣有益菌數量和改善養殖環境。洪文等[49]研究也表明，適量凝結芽孢桿菌可以提高斷奶仔豬生長性能，減少腹瀉。

6 臨床研究

凝結芽孢桿菌由于具有調節腸道微生態平衡、促進消化吸收和增強免疫力等生物學功能，且安全有效，越來越多的國內外學者開始關注凝結芽孢桿菌臨床應用研究。凝結芽孢桿菌除了對慢性結腸炎、腹瀉和便秘、呼吸道感染、陰道炎等疾病均有顯著的治療效果，還具有調節肌肉損傷和提高免疫力的功效。

大量臨床研究表明，凝結芽孢桿菌可以用來治療腸道易激綜合癥、腸道失調綜合癥等，能夠減小腹瀉、腹脹、腹痛、嘔吐、排便次數和增強腸道運動性[50-53]。Dutta等[54]評估了凝結芽孢桿菌作為益生菌類微生物菌劑對小兒腹瀉的臨床療效，結果顯示凝結芽孢桿菌進入腸道分泌大量乳酸，恢復腸動力，抑制腸道有害菌并排除腸毒素，恢復腸道菌群平衡。2009年，國外學者[29]研究發現凝結芽孢桿菌能夠增加感染甲型流感病毒患者的T細胞產生TNF-腫瘤壞死因子。侯占英、黎素清[55-56]發現凝結芽孢桿菌活菌片能夠降低3歲以下小兒反復呼吸道感染發生率，減少抗生素的使用。

Ralf等[57]發現補充凝結芽孢桿菌聯合蛋白能夠降低肌肉損傷，加快復原。Jepner等[58]報道了凝結芽孢桿菌能夠增強2-甲基-2-羥基丁酸鈣（β-hydroxy-βmethylbutyrate calcium，CaHMB）（一種被證實能夠增強高強度訓練導致的肌肉損傷）對軍事訓練引起肌肉損傷的復原，并能引起細胞因子反應。

Riazi等[59]將凝結芽孢桿菌發酵液濃縮10倍檢測對陰道炎致病菌藤黃微球菌的抑制作用，結果顯示凝結芽孢桿菌是一種安全有效的抑菌制劑；翟新茹等[60]將凝結芽孢桿菌活菌片聯合甲硝唑栓治療細菌性陰道病療效顯著，能降低復發率。以上研究表明凝結芽孢桿菌在細菌性陰道炎的治療中具有潛在應用價值。

此外，凝結芽孢桿菌能夠預防新生兒黃疸[61]，對風濕性關節炎[28]、口瘡性口炎、齲齒[62]、嬰兒濕疹[63]等疾病具有臨床應用價值。

7 小結與展望

微生物發酵產物作為抑菌制劑具有天然高效的優點，是化學藥物和抗生素的理想替代品。目前，對其應用的相關研究較多，作用機理研究較少，其安全性評價也不夠全面。雖然部分微生物來源的抑菌制劑已經投入市場，但是天然抑菌制劑較高的價格以及其安全性評價不足阻礙了其更進一步推廣和應用，僅有細菌素Nisin（Nisin是一種細菌素）等少數物質被發現并應用。研究人員進一步對產生相關抑菌物質的菌株進行遺傳改良，進而提高產量，降低生產成本，對高效安全并且經濟實用的天然抑菌制劑的開發具有重要意義。

凝結芽孢桿菌的代謝產物研究較少，僅限于具有抑菌活性的多肽類和抗氧化活性的多糖類大分子的研究，其代謝產物除了有機酸、胺外，尚未見其它小分子報道。凝結芽孢桿菌可以提高機體免疫能力，但其起免疫作用的物質基礎還不明確，因此對凝結芽孢桿菌免疫作用的物質基礎進行進一步開發利用具有重要意義。

總之，凝結芽孢桿菌作為抑菌制劑的研究尚屬起步階段，但隨著學者們對其研究的進一步深入，包括抑菌物質基礎研究、抑菌機制探索以及提取工藝的優化等，凝結芽孢桿菌必將在食品安全方面發揮重要作用。同時作為綠色高效抑菌制劑的應用范圍將更加廣泛。