動脈粥樣硬化患者載脂蛋白C3高表達

俞 娟，熊怡淞，王旭東，仲人前

(1.南通大學附屬醫(yī)院 檢驗科，江蘇 南通226001;2.成都軍區(qū)總醫(yī)院 檢驗科，四川 成都610083；3.第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院 實驗診斷科 全軍臨床免疫中心，上海200003)

動脈粥樣硬化(AS)是一種多因素復雜性疾病，解剖及病理研究發(fā)現粥樣斑塊中聚集有大量的脂質、巨噬細胞、淋巴細胞及血小板，還伴有平滑肌細胞的增生等，但其發(fā)病機制尚未完全闡明。長期以來公認的甘油三酯(TG)升高與冠心病(CHD)風險成正相關，而TG升高是否作為CHD一個獨立的風險因子仍有爭議。近年來研究表明，TG 是CHD的風險因子，而餐后的TG水平更是其獨立危險因素[1]。APOC3在血漿TG代謝中起重要作用，血漿APOC3水平與血漿TG水平成正相關，與餐后TG清除率成負相關[2]。膽固醇和復發(fā)事件(CARE)臨床試驗結果顯示，與TG相比，APOC3是CHD更強有力的預測者，是獨立風險因子[3]。

國外已進行大規(guī)模臨床實驗，低膽固醇動脈粥樣硬化研究(CLAS)和監(jiān)測動脈粥樣硬化轉歸研究(MARS)結果顯示，血漿APOC3-LpB(含APOB脂蛋白即TRL中的APOC3)能預測經血管造影證實的冠狀動脈狹窄進展程度[4,5]。MARS發(fā)現，獨立于LDL-C濃度，富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)中APOC3濃度能預測疾病進展的風險。而國內CHD患者人群的血漿APOC3水平及其亞組分的測定鮮有報道，本研究主要是應用全自動生化儀檢測CHD患者血漿總APOC3、TRL- APOC3、HDL-APOC3以及常規(guī)血脂檢測，探討APOC3在冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1研究對象 收集2010年8月-2011年6月上海第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院心內科經冠狀動脈造影或手術檢查的患者信息，其中冠狀動脈無狹窄的心臟病患者20例，年齡、性別等匹配的冠狀動脈有狹窄的心臟病患者195例。

詳細記錄入選研究對象的冠狀動脈造影或手術檢查結果，并根據這些結果對其進行分組。首先，根據冠脈主要血管是否存在狹窄進行分組，分為冠脈無狹窄組(non-AS組)和冠脈狹窄患者組(AS組)；再根據有無冠心病進行分組，行冠狀動脈造影陽性(至少1支冠狀動脈直徑狹窄≥50%)，并根據1979年WHO的標準診斷為冠心病的患者(CHD組)，冠脈無狹窄的對照組(non-CHD組)。最后根據冠脈主要血管狹窄程度進行分組：A組定義為主要血管未見狹窄的對照組；B組定義為主要血管狹窄<50%的患者組；C組定義主要血管狹窄為50%-75%的患者組；D組定義為主要血管狹窄>75%的患者組。

研究對象均為無血緣關系的華東地區(qū)漢族人群。

1.1.2主要試劑 APOC3測定試劑盒(日本積水公司產品，原為日本第一化學株式會社)，Tch和TG測定試劑盒(上海科華生物有限公司)，HDL-C測定試劑盒(上海申索佑福醫(yī)學診斷用品有限公司)，LDL-C測定試劑盒(上海科華生物有限公司)，APOA1測定試劑盒(上海科華生物有限公司)，APOB測定試劑盒(上海申索佑福醫(yī)學診斷用品有限公司)，磷鎢酸-鎂沉淀劑(自配)：稱取磷鎢酸鈉0.44 g，MgCl2·6H2O 1.10 g，溶于蒸餾水80 ml中，以1 mmol/L NaOH調pH至100 ml。

1.1.3主要儀器 全自動生化分析儀(日本Hitachi 7020)，-80℃超低溫冰箱(美國REVCO公司)，恒溫水浴箱、普通冰箱、離心機、EP管、TIP頭 (國產)

1.2實驗方法

1.2.1標本收集 空腹12-14 h抽取外周靜脈血3 ml，凝固后離心分離血清，2 h內測定或者凍存于-80℃冰箱。

1.2.2標本測定 血清TG、Tch應用氧化酶法測定，HDL-C和LDL-C應用直接測定法測定其中的膽固醇，APOA1、APOB、APOC3采用免疫比濁法，APOC3亞組分的測定采用磷鎢酸-鎂沉淀劑沉淀去除非HDL成分，即CM、LDL、VLDL。首先測定上清液HDL組分中APOC3(HDL-APOC3)，再用血清總APOC3減去HDL中APOC3得到TRL中APOC3(TRL-APOC3)。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1動脈粥樣硬化患者血清APOC3及其血脂的表達情況

如表1所示，與對照組(無狹窄組)相比，AS組(有狹窄組)的患者血漿總APOC3水平較對照組顯著升高(9.46 g/L比7.42 g/L)，APOA1和HDL-C濃度則降低(分別為1.23 g/L比1.40 g/L，1.09 g/L比1.24 g/L)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而APOC3亞組成分TRL-APOC3和HDL-APOC3、TG、Tch(總膽固醇)、LDL-C(低密度脂蛋白膽固醇)、APOB，在2組間均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 AS組和對照組血脂和載脂蛋白水平比較

注：與對照組比較,*P<0.05

2.2冠心病患者血清APOC3及其血脂的表達情況

如表2所示，與對照組(非CHD組)的心臟病患者相比，CHD組的患者血漿總APOC3水平顯著升高(9.46 g/L比7.43 g/L)，APOA1和HDL-C濃度則降低(分別為1.22比1.40 g/L，1.09比1.24 g/L)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而APOC3亞組成分TRL-APOC3和HDL-APOC3、TG、Tch、LDL-C、APOB，在2組間均無顯著性差異(P>0.05)。

2.3血清APOC3濃度與動脈狹窄程度的關系

如表3所示，與A組(無狹窄組)相比，不同程度的動脈狹窄組B組、C組、D組的患者血清中總APOC3水平均顯著升高(分別為7.43 g/L比9.49 g/L、9.85 g/L、9.37 g/L)，差異有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；而狹窄組之間的APOC3水平無顯著性差異(P>0.05)。

表2 CHD組和對照組血脂和載脂蛋白水平比較

注：與對照組比較,*：P< 0.05

表3 APOC3濃度與動脈狹窄程度的關系比較

注：與A組比較*：P<0.05

3 討論

動脈粥樣硬化是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎，嚴重危害人類健康。隨著我國生活水平的提高，動脈粥樣硬化性疾病已躍居于人口死亡的主要原因之列[6]。在形成AS的各因素中，血脂代謝異常起重要作用，而APOC3的增加可能與此相關。大量研究報道，血漿TG是CHD的風險因子，APOC3水平與TG存在直線正相關關系，APOC3更是比TG更有力的CHD的獨立風險因子[7]。來自動物實驗的報道也顯示，APOC3引起TG升高，前者是始發(fā)因素[8]。APOC3能抑制甘油三酯的水解，在TRL的代謝中具有關鍵作用，獨立于低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)或高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，與CVD風險增加有關[9]。APOC3功能喪失突變攜帶者體內血漿TG降低，HDL-C升高，冠狀動脈鈣化的負擔減少，在一般人群中APOC3缺乏可減少冠狀動脈粥樣硬化[10]。不管是冠脈事件的再發(fā)風險還是經過多年隨訪發(fā)現死于CHD的風險，血漿中APOC3的高表達在其中均起相當的作用[11]。鑒于血漿APOC3大量的研究報道均來自于國外，考慮到種族差異的影響，我們對華東地區(qū)漢族人群的APOC3水平進行檢測。

我們的實驗結果發(fā)現，TG雖在AS組和CHD組較高，但是差異無顯著性意義，原因可能是研究對象已經服用過降脂藥物，而使結果有所偏低。從表1和表2的結果我們可以看出，與對照組(無狹窄組)相比，AS組(有狹窄組)和CHD組的患者血漿總APOC3水平顯著升高(P<0.05)，而APOC3亞組成分TRL-APOC3和HDL-APOC3在2組間無顯著差異，TG在2組間也沒有統(tǒng)計學差異。說明APOC3不管存在于TRL中或HDL中，累積的量即總APOC3在組間是有顯著差異的，這和Kawakami課題組在對細胞實驗進行機制研究的結論不謀而合[12]，他們發(fā)現不僅TRL中的APOC3能引起血管內皮細胞和單核細胞活化，啟動相關信號通路而導致細胞間粘附增加，存在于HDL中的APOC3同樣抑制HDL的抗細胞粘附作用，換言之，APOC3雖存在于不同的脂蛋白顆粒上，但效應是相同的，最終結果都是導致細胞粘附率增加。另外的研究報道，HDL中的APOC3使前者功能紊亂，成為糖尿病的風險因子[13]。我們的結果顯示，APOC3無論存在于TRL還是HDL，只要它的總量增高到一定程度，就與AS相關。本部分研究對象的血清APOC3濃度與其他研究相比，結果偏低，在AS組中APOC3亞組分TRL- APOC3和HDL-APOC3中的濃度相對于對照組雖有增高趨勢，但無統(tǒng)計學差異，推測可能也是研究對象服用過降脂藥物的緣故。因為臨床上所用的降脂藥物幾乎均有降低APOC3效應[7]。Fibrates是貝特類降脂藥物，具有降低TG和獨立抗AS作用，能降低APOC3基因表達；Statins是他汀類降脂藥物，降低APOC3的mRNA表達和血漿中的蛋白水平；魚油、煙酸等降脂藥物都不同程度降低APOC3表達。

我們在收集臨床標本的時候，很難發(fā)現已患CHD的患者，還沒有用過降脂藥物，因為此病為復雜性疾病，當出現相應癥狀時，可能早就發(fā)生脂質代謝紊亂，并發(fā)2型糖尿病(T2DM)或高血壓。即使由于應用降脂藥物而使APOC3血漿濃度下降，或即使一線醫(yī)生能夠了解用藥劑量和時間，但用藥前的蛋白水平我們已無從知曉，而長期的高APOC3導致的各種損傷，特別是已經形成的AS則已不可逆轉，其導致不同研究的CHD人群血漿APOC3水平的差異。因此，發(fā)現CHD組中APOC3水平不高也并不一定代表它的實際病理情況，應該排除使用降脂藥物的影響，否則會引起結論偏倚。

為了研究血漿總APOC3濃度與冠脈狹窄程度是否有差異，我們將冠脈狹窄程度分為A、B、C、D 4個級別，A組為無狹窄組，B組為狹窄<50%，C組為狹窄為50%-75%，D組為狹窄>75%。結果正如表3所示，與A組(無狹窄組)相比，不同程度的動脈狹窄組B組、C組、D組的患者血清中總APOC3水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；而狹窄組之間的總APOC3水平無顯著性差異(P>0.05)。以上結果說明，血漿總APOC3在血管發(fā)生狹窄的人群中高表達，與狹窄的程度無明顯相關性。

為了進一步了解冠脈狹窄患者的情況，我們通過檢測常規(guī)血脂水平發(fā)現具有心血管保護作用的APOA1和HDL-C血漿濃度在有狹窄組和冠心病組的患者中是降低的(P<0.05)，這與文獻報道一致，Tch、LDL-C、APOB等在組間均無顯著性差異(P>0.05)。

綜上所述，本研究結果顯示，在我國華東地區(qū)漢族人群中，血清總APOC3濃度在冠脈狹窄患者中升高，而與狹窄的程度無顯著相關性。APOC3亞組成分TRL-APOC3和HDL-APOC3在組間無顯著性差異。

[1]Pollin TI,Damcott CM,Shen H,et al.A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection[J].Science,2008,322(5908):1702.

[2]Zvintzou E,Lhomme M,Chasapi S,et al.Pleiotropic Effects of Apolipoprotein C3 on HDL Functionality and Adipose Tissue Metabolic Activity[J].J Lipid Res.2017,58(9):1869.

[3]Sacks FM,Alaupovic P,Moye LA,et al.VLDL,apolipoproteins B,CIII,and E,and risk of recurrent coronary events in the Cholesterol and Recurrent Events (CARE) trial[J].Circulation,2000,102(16):1886.

[4]Blankenhorn DH,Alaupovic P,Wickham E,et al.Prediction of angiographic change in native human coronary arteries and aortocoronary bypass grafts.Lipid and nonlipid factors[J].Circulation,1990,81(2):470.

[5]Hodis HN,Mack WJ,Azen SP,et al.Triglyceride- and cholesterol-rich lipoproteins have a differential effect on mild/moderate and severe lesion progression as assessed by quantitative coronary angiography in a controlled trial of lovastatin[J].Circulation,1994,90(1):42.

[6]李 靚,謝 巍,姜志勝,等.我國動脈粥樣硬化基礎研究近三年進展[J].中國動脈硬化雜志,2015,23(11):1182.

[7]Ooi EM,Barrett PH,Chan DC,et al.Apolipoprotein C-III:understanding an emerging cardiovascular risk factor[J].Clin Sci (Lond),2008,114(10):611.

[8]Ito Y,Azrolan N,O′Connell A,et al.Hypertriglyceridemia as a result of human apo CIII gene expression in transgenic mice[J].Science,1990,249(4970):790.

[9]Giuseppe Danilo N,Sotirios T,Angela P,et al.Apolipoprotein C-III:From Pathophysiology to Pharmacology[J].Trends in Pharmacological Sciences,2015,36(10):675.

[10]Natarajan P,Kohli P,Baber U,et al.Association of APOC3 Loss-of-Function Mutations With Plasma Lipids and Subclinical Atherosclerosis:The Multi-Ethnic BioImage Study[J].J Am Coll Cardiol,2015,66(18):2053.

[11]Olivieri O,Martinelli N,Girelli D,et al.Apolipoprotein C-III predicts cardiovascular mortality in severe coronary artery disease and is associated with an enhanced plasma thrombin generation[J].J Thromb Haemost,2010,8(3):463.

[12]Kawakami A,Aikawa M,Libby P,et al.Apolipoprotein CIII in apolipoprotein B lipoproteins enhances the adhesion of human monocytic cells to endothelial cells[J].Circulation,2006,113(5):691.

[13]Onat A,Hergenc G,Ayhan E,et al.Serum apolipoprotein C-III in high-density lipoprotein:a key diabetogenic risk factor in Turks[J].Diabet Med,2009,26(10):981.